甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝损伤的保护作用

杜金梁，曹丽萍，贾 睿，顾郑琰，何 勤，徐 跑，，JENEY Galina，马玉忠，殷国俊，，*

(1.中国水产科学研究院 淡水渔业研究中心/农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏 无锡 214081； 2.中国水产科学研究院 淡水渔业研究中心/鱼类免疫药理学国际联合实验室，江苏 无锡 214081； 3.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001； 4.南京农业大学 无锡渔业学院，江苏 无锡 214081； 5.匈牙利水产与渔业研究所 国家农业研究中心，匈牙利 索尔沃什 5440)

脂肪肝损伤在罗非鱼(Oreochromisniloticus)养殖过程中频繁发生，是一种常见多发性疾病。罗非鱼患此病后机体通常会表现为免疫力下降、增重缓慢、肉质差、抗应激能力降低，若此病发生在夏季，患病罗非鱼更容易受到细菌病、病毒病的侵袭，造成鱼类大面积死亡，给养殖户造成巨大的经济损失，严重阻碍罗非鱼养殖业的健康发展。研究表明，鱼类脂肪肝损伤主要受以下几种因素影响：饲料配方配比不合理、养殖密度过大、养殖环境差等[1-3]。关于鱼类脂肪肝的发病机理，有学者认为是由于肝内脂肪合成和代谢发生紊乱，使得肝内脂质合成和脂质氧化之间失衡所致[4-5]。也有学者认为氧化应激反应是造成脂肪肝损伤的诱因[6-7]，到目前为止，关于鱼类脂肪肝具体发病机制依然没有定论。养殖过程中多采用在饲料中添加抗脂肪因子、肉碱等西药防治鱼类脂肪肝损伤，虽然取得了一定疗效，但治疗效果并不理想，且过多使用容易造成鱼体内药物残留，导致养殖环境污染，进而影响人类健康。因此，急需研发绿色无残留的抗脂肪肝药物。目前，关于抗鱼类脂肪肝损伤药物筛选的报道还较少，学者们主要围绕草鱼和斑马鱼开展了少量研究，如饲料中添加L-肉毒碱、胆汁酸等可以有效降低草鱼的体脂含量和肝脂含量[8-9]；制首乌醇提取物对斑马鱼非酒精性脂肪肝具有较好的治疗效果[10]；垂盆草提取物对于草鱼脂肪性肝损伤具有良好治疗作用[11]。当前大部分治疗脂肪肝药物筛选研究主要集中在哺乳动物，二苯乙烯苷、大麻二酚、欧芹根总黄酮等药物对大鼠非酒精性脂肪肝损伤具有较好的治疗作用[12-14]，治疗罗非鱼脂肪肝损伤药物的筛选还鲜有报道。

随着人类生活水平的不断提高，鱼作为餐桌上的必备食材，其安全性越来越受到重视，绿色健康养殖就显得尤为重要。中草药具有绿色无公害、无毒副作用、无药物残留等优点，被广泛用于治疗疾病，具有很好的应用前景。甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)是临床上应用较广的一种中草药，其具有抗炎杀菌、保肝护肝等功效。甘草总黄酮(Glycyrrhizatotal flavones)是甘草提取物有效成分之一，关于甘草总黄酮治疗哺乳动物脂肪肝的报道较多。甘草总黄酮对SD大鼠非酒精性脂肪肝具有干预作用[15]；甘草黄酮提取物能够调节大鼠血糖血脂[16]；甘草黄酮分散片可以修复四氯化碳造成的小鼠肝损伤[17]。目前甘草总黄酮对罗非鱼脂肪肝损伤是否有治疗作用未见报道。本研究以罗非鱼作为实验对象，用高脂饲料构建罗非鱼脂肪肝损伤模型，探索甘草总黄酮对高脂条件诱导下罗非鱼肝损伤是否具有保护作用，为开发罗非鱼绿色保肝药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

罗非鱼购于中国水产科学院淡水渔业研究中心屺亭渔场，体表完好、游姿正常，体重为(30±1)g。实验开始前放置于循环水养殖系统中暂养1周，水温设定为(30±1)℃，每天上午和下午各投喂1次饲料。

甘草总黄酮购于上海源叶生物科技有限公司(货号：S25400)；甘油三酯(triglyceride， TG)、总胆固醇(total cholesterol， TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde， MDA)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity， T-AOC)试剂盒购自南京建成海浩生物工程有限公司；蛋白水平测定所需试剂购于上海碧云天生物技术有限公司；荧光定量PCR所需试剂购于宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 饲料组方与试验分组

选取180尾健康、无伤，体重为(30±1) g的罗非鱼，随机分为6组，每组30尾鱼，分别为空白对照组、高脂饲料模型组和4个不同浓度(0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg-1)甘草总黄酮药物处理组。每组设定3个重复，每个重复10尾鱼。每日饲喂2次，按体重的4%来确定饲喂量，连续饲喂90 d。空白对照组：仅饲喂基础饲料(粗脂肪含量为6%)；高脂组：投喂高脂饲料(粗脂肪含量为21%)；甘草总黄酮药物处理组：分别在高脂饲料中添加0.05、0.10、0.50、1.00 g·kg-1甘草总黄酮。各实验组日粮情况参照实验室饲料配方改良而成[18]，如表1所示。

表1 实验组日粮组成

1.2.2 样本采集与处理

连续饲喂90 d后，采集罗非鱼肝进行肝匀浆液制备，并提取肝蛋白质。肝匀浆液制备：将罗非鱼肝用0.9% NaCl溶液漂洗，然后用匀浆器制成10%的肝匀浆液，3 500g离心10 min后，取上清液于-80 ℃冰箱保存备用。肝蛋白质提取：将肝用剪刀剪碎，加入细胞裂解液提取蛋白质，以每20 mg肝加入150 μL裂解液为准，充分裂解后，放入离心机10 000～14 000g离心3～5 min，取上清进行后续试验操作。蛋白质浓度的测定参照蛋白质定量测定试剂盒说明书。

1.2.3 生化指标测定

取肝匀浆上清液按照说明书测定SOD活性、GSH活性、MDA含量、TG含量、TC含量、T-AOC水平。

1.2.4 核转录因子-κB C-Rel和κB P 65蛋白表达水平检测

Western blot参照张燕婉等[19]的方法，肝蛋白样品经过变性、SDS-PAGE电泳、半干转膜仪转膜、封闭液封闭、一抗孵育、二抗孵育、化学发光显色等步骤后，检测罗非鱼肝中核转录因子-κB C-Rel和κB P 65蛋白表达情况。

1.2.5 荧光定量PCR

采用Trizol法提取罗非鱼肝中总RNA，具体提取步骤参照Takara RNA提取试剂盒说明书进行。用全自动酶标仪测定总RNAD260/D280值，然后按照Takara反转录试剂盒说明书进行反转录反应。制备好的cDNA样本将用于荧光定量PCR试验。荧光定量PCR所采用试剂来自宝生物工程(大连)有限公司，MTTP、ApoB100基因相对表达量采用2-ΔΔCt法[20]计算。qRT-PCR所用引物见表2。

表2 qRT-PCR引物信息

1.3 数据处理

实验数据用SPSS19.0软件包中单因素ANOVA方法进行统计分析，结果用平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝中TC、TG含量的影响

如图1所示，投喂高脂饲料90 d，罗非鱼肝中TC、TG含量与对照组相比极显著升高(P<0.01)。与高脂组相比，投喂含有不同浓度的甘草总黄酮饲料后，罗非鱼肝中TC、TG含量不同程度降低，1.00 g·kg-1甘草总黄酮组罗非鱼肝中TC含量显著降低(P<0.05)，0.50 g·kg-1甘草总黄酮组罗非鱼肝中TG含量极显著降低(P<0.01)。说明甘草总黄酮对于高脂饲料造成的罗非鱼肝脂肪沉积有一定的缓解作用。

2.2 甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝中GSH活性的影响

如图2所示，投喂高脂饲料后，与对照组相比，罗非鱼肝中GSH活性极显著降低(P<0.01)；投喂含不同浓度的甘草总黄酮饲料后，0.50 g·kg-1甘草总黄酮组保肝效果较好，肝中GSH活性显著(P<0.05)高于高脂组，其他药物组GSH活性与高脂组相比无显著差异(P>0.05)。表明甘草总黄酮对高脂饲料造成的罗非鱼肝抗氧化系统损伤具有一定的保护作用。

2.3 甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝中SOD活性的影响

如图3所示，投喂高脂饲料后，与对照组相比，罗非鱼肝中SOD活性极显著(P<0.01)降低；饲料中加入不同浓度甘草总黄酮后，与高脂组相比，0.50 g·kg-1甘草总黄酮组罗非鱼肝中SOD活性显著升高(P<0.05)，这表明甘草总黄酮对高脂饲料造成的罗非鱼肝氧化损伤具有一定的保护作用。

2.4 甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝中T-AOC水平的影响

如图4所示，投喂高脂饲料后，罗非鱼肝中T-AOC水平较对照组极显著下降(P<0.01)；投喂含有不同浓度的甘草总黄酮饲料后，与高脂组相比，0.05 g·kg-1、0.10 g·kg-1和0.50 g·kg-1甘草总黄酮组罗非鱼肝中T-AOC水平均显著升高(P<0.01或P<0.05)，以0.10 g·kg-1甘草总黄酮组升高幅度最大。这表明甘草总黄酮可以提高罗非鱼肝的抗氧化能力，抑制高脂饲料造成的罗非鱼肝损伤。

2.5 甘草总黄酮对高脂条件下罗非鱼肝中MDA含量的影响

如图5所示，与对照组相比，投喂高脂饲料组罗非鱼肝中MDA含量极显著升高(P<0.01)；投喂含不同浓度的甘草总黄酮饲料后，罗非鱼肝中MDA含量与高脂组无显著差异(P>0.05)。

2.6 甘草总黄酮对NF-κB C-Rel、NF-κB P65 蛋白表达的影响

如图6所示，与对照组相比，高脂饲料组罗非鱼肝中NF-κB P65蛋白和C-Rel蛋白表达水平极显著(P<0.01)增加，这说明高脂饲料诱导了NF-κB相关蛋白的表达；饲料中加入不同浓度甘草总黄酮进行干预后，肝中NF-κB C-rel和NF-κB P 65蛋白表达水平不同程度降低，与高脂组相比，0.50 g·kg-1甘草总黄酮组降低显著(P<0.05)，说明甘草总黄酮可以促进肝中脂蛋白的代谢，减轻肝损伤。

2.7 甘草总黄酮对MTTP、ApoB100基因表达的影响

如图7-A所示，高脂饲料组罗非鱼肝中MTTPmRNA表达水平显著(P<0.05)低于对照组，饲料中加入甘草总黄酮干预后，0.10 g·kg-1、0.50 g·kg-1和1.00 g·kg-1甘草总黄酮组罗非鱼肝中MTTPmRNA表达水平极显著(P<0.01)高于高脂组。由图7-B可知，高脂组罗非鱼肝中ApoB100 mRNA表达水平极显著(P<0.01)低于对照组，饲料中加入甘草总黄酮干预后，0.50 g·kg-1和1.00 g·kg-1甘草总黄酮组罗非鱼肝中ApoB100 mRNA表达水平极显著(P<0.01)高于高脂组。综上，推测甘草总黄酮可以促进脂肪在肝中转运和代谢，减轻脂肪蓄积造成的肝损伤。

3 讨论

目前，鱼类脂肪肝发病机理研究众多，但是造成鱼类肝损伤的具体发病机制尚不清晰，且不同品种鱼类发病机制可能存在差异；因此，深入研究鱼类肝损伤的发病机理和药物筛选工作，对于防治鱼类脂肪肝损伤疾病具有重要意义。本研究主要从生化指标、分子生物学指标来探讨高脂饲料对罗非鱼造成肝损伤的情况，并评价饲料中添加甘草总黄酮是否对高脂饮食造成的罗非鱼肝损伤具有保护作用。

3.1 甘草总黄酮对罗非鱼肝中TG、TC含量的影响

甘油三脂和总胆固醇是临床上诊断脂肪肝疾病的常用指标，脂肪肝患者血清中TG、TC含量通常会出现升高现象[21-23]。近些年来，随着研究人员对鱼类脂肪肝损伤研究的不断深入，TG、TC这2个经典指标被科技工作者们广泛应用到水产动物中。有研究指出，患有脂肪肝损伤鱼类的血清或者肝中血脂水平也呈升高趋势[24-28]。本实验结果与前人研究结果类似，罗非鱼饲喂高脂饲料90 d后，肝匀浆中TG、TC含量极显著升高，这表明在高脂饲料的诱导下，罗非鱼肝中脂肪代谢出现障碍，造成脂肪在肝中蓄积。而饲料中加入甘草总黄酮药物进行干预后，可以不同程度降低肝中TG、TC的含量，这表明甘草总黄酮对于促进脂肪代谢，减少脂肪在罗非鱼肝中沉积具有一定的效果。已经有学者在小鼠上得出了类似结果。王晶等[29]、刘国栋[30]研究表明，甘草总黄酮对小鼠高脂血症有较好的干预作用，这说明甘草总黄酮不仅可以促进哺乳动物机体脂质代谢，对水产动物也具有较好的治疗效果。

3.2 甘草总黄酮对罗非鱼肝中抗氧化指标的影响

抗氧化酶系统在维护机体健康方面发挥着重要作用，外界病原或者微生物侵害机体时，体内的抗氧化酶系统就会被激活，保护机体免受致病因素损害[31]。SOD、GSH、T-AOC是评判机体抗氧化能力的常用生化指标[32-33]。MDA是生物体脂质过氧化产物，脂质过氧化反应也是判定机体健康与否的重要因素，在致病因素的作用下，机体中MDA含量会不断升高，导致细胞膜受损伤，细胞出现代谢功能障碍，继而引发一系列病理反应[34]。有报道证实，鱼类肝损伤疾病的发生与氧化应激反应密切相关。Cao等[35]研究发现，甘草提取物对叔丁基氢过氧化物(t-BHP)可以导致建鲤肝产生大量自由基，造成肝细胞损伤。杜金梁等[36]研究发现，甘草提取物抗环境致毒物二噁英造成的鱼肝损伤也与氧化应激存在关联。在本研究中，投喂高脂饲料90 d后，罗非鱼肝匀浆中GSH活性、SOD活性、T-AOC水平均降低，MDA含量升高，表明高脂饲料诱导罗非鱼肝发生了氧化应激反应，使罗非鱼机体氧化系统和抗氧化系统出现失衡，导致罗非鱼肝受损伤，肝中各生化指标随之发生变化。当饲料中加入不同浓度甘草总黄酮后，各药物实验组罗非鱼肝GSH活性、SOD活性和T-AOC水平均不同程度升高，MDA含量降低。这说明甘草总黄酮可以帮助机体抵抗氧化应激造成的损害，减少自由基的产生，维持机体平衡状态。

3.3 甘草总黄酮对罗非鱼肝中核转录因子蛋白水平的影响

NF-κB作为核转录因子，其家族成员众多，NF-κB P65和C-Rel是学者们研究比较多的2个家庭成员。已经有大量文献报道NF-κB信号通路与肝疾病的发生发展存在关联[37-38]，肝受损伤后核转录因子会被激活。如郭威等[39]发现，L-谷氨酰胺可以抑制小鼠肝中NF-κB P65蛋白的表达；刘英娟等[40]发现，低浓度的槲皮素可抑制NF-κB P65和C-Rel蛋白表达。本研究结果与刘英娟等[40]的报道类似，高脂饲料显著诱导了罗非鱼肝中NF-κB P65蛋白和C-Rel蛋白表达，表明高脂饲料引起肝受损后激活了罗非鱼肝中核转录因子，造成肝内蛋白的分泌和合成出现异常。饲料中在加入甘草总黄酮后，NF-κB p65蛋白和C-Rel蛋白表达不同程度降低，这说明甘草总黄酮对高脂饲料造成的罗非鱼肝核转录因子蛋白表达具有一定抑制作用，能促进脂蛋白在肝内转运和代谢，可以减轻肝损伤。

3.4 甘草总黄酮对罗非鱼肝中极低密度脂蛋白组装相关基因表达的影响

MTTP和ApoB100基因同属于卵黄蛋白原家族成员，是肝中脂蛋白分泌和代谢所必需的重要转移蛋白，它们在维持肝正常生理功能方面发挥着重要作用[41]。MTTP基因主要通过与载脂蛋白B共同作用来实现肝中脂质蛋白的转运。研究发现，当肝中MTTP基因表达水平降低时，载脂蛋白B的合成量也会随着降低，肝脂质代谢会出现紊乱，引发脂肪肝疾病的发生[42-43]。本研究也出现类似结果，高脂饲料投喂罗非鱼后，MTTP和ApoB100 mRNA表达水平均降低，这说明高脂饮食造成罗非鱼肝中脂类合成和代谢出现障碍，肝中脂类物质不能及时转运，造成脂类物质在肝中不断蓄积。在高脂饲料中加入甘草总黄酮干预后，MTTP和ApoB100 mRNA表达水平升高，这表明甘草总黄酮可以促进脂类物质在罗非鱼肝中转运，缓解脂类物质在肝中不断蓄积所造成的损害。

综上，长时间投喂高脂饲料可以造成罗非鱼肝氧化应激损伤，而饲料中添加0.50 g·kg-1甘草总黄酮对高脂饮食造成的肝损伤有一定的缓解作用，可以促进脂类物质的快速代谢，避免脂类物质的持续聚集所造成的损害，减轻肝炎症反应，增强罗非鱼机体的抗氧化能力。本研究结果对后期开发治疗罗非鱼脂肪肝药物具有一定的指导意义，甘草总黄酮具体药理作用还需进一步研究。