非洲猪瘟病毒特异性抗体检测研究进展

祁元明，陈玉梅，2，王爱萍，2

(1.郑州大学生命科学学院，河南 郑州 450001； 2.河南省免疫生物学重点实验室，河南 郑州 450001)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是发生于野猪和家猪之间的急性、热性和高度接触性传染病，其病程短，致死率高，对全世界养猪业造成严重威胁[1-2]。据统计,2018—2019年全世界共销毁了大约3 000万头猪，造成高达20亿美元的经济损失[2]。 2018-08-03农业农村部确认沈阳市发生非洲猪瘟疫情，疫情范围从东部、北部地区向西部和南部地区扩散，随后蔓延至全国，给中国造成巨大经济损失，严重影响中国养猪业健康发展。

非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的线性双链DNA病毒，平均直径200 nm，为20面体对称的囊膜病毒[3]，其基因组长约170～193 kb之间，可编码包括 p72蛋白、p54蛋白、p12蛋白、pp220蛋白、pp62蛋白、p30蛋白以及血凝素等在内的 50多种病毒结构蛋白，这些蛋白大都与病毒吸附、毒力、细胞凋亡、宿主范围及免疫应答相关[4-6]。ASFV结构复杂，拥有复杂的免疫逃逸机制，目前尚无有效的疫苗[7]。ASFV可通过软蜱在疣猪、丛林猪和野猪之间传播，或通过与受感染动物直接或间接接触的环境、病媒和动物产品传播[8-9]。目前，防治ASFV传播的最有效手段依然是严格的卫生和生物安全控制，而有效防控的第一步依赖于ASFV快速、可靠的早期诊断。

1 非洲猪瘟病毒特异性抗体检测的意义

ASFV常用的诊断技术包括检测和识别ASFV特异性抗原、DNA或抗体等[10]。其中，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative，qPCR)，以及新型多重反转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)最为常见[11]。前两者是监测由特急性、急性或亚急性ASFV感染动物造成的长期病毒血症和高病毒载量的基本诊断工具[12-14]，也是ASFV早期检测的金标准。但是，由于该技术需要专门的设施和培训，仅限于实验室诊断，而不适合用于现场实时诊断。ASFV特异性抗原检测的主要方法包括病毒分离(virus isolation,VI)[15]、红细胞吸附试验(haemadsorption,HAD)[16]、直接荧光抗体法(direct fluorescent antibody test，DFA)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)[17-18]等。ELISA检测病毒抗原成本比PCR低，适合于短时间内对样品的大规模筛查，然而对于亚急性和慢性病例敏感性明显低于PCR。因此，抗原ELISA主要用于群体检测，并辅助以其他病毒学和血清学检测。

血清学检测主要是指抗体检测，常用的方法有ELISA[19]、免疫印迹试验(immunoblotting test,IB)、间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescent assay，IFA)、间接免疫过氧化物酶试验(indirect immuno-peroxidase test，IPT)[20]。联合国粮食及农业组织(food and agriculture organization of the United Nations，FAO)建议使用ELISA进行初步筛查，另外3种方法作为确认试验。GALLARDO等[21]于2015年报道，在欧洲出现无红细胞吸附反应的基因Ⅰ型ASFV弱毒株NH/68，猪感染该毒株后表现为慢性感染症状，且病猪在感染3个月后仍可以散毒，这就表明慢性感染猪会成为长期的传染源。ASFV抗体阳性测试表明，当动物患有持续感染或正从过去的感染中恢复时(并可能终生血清反应阳性)，这些抗体的效价可以反映受感染动物的生存时间。另外，方便、廉价、快速的抗体检测可用于大规模流行病学调查和对于无症状感染/康复猪的筛查。

2 非洲猪瘟病毒特异性抗体检测样本类型

2.1 首选样本

ASFV特异性抗体检测首选样本包括全血样本和血清样本。全血样本一般使用含有抗凝剂(使用EDTA，不可用肝素)的采血管从猪的静脉中抽取全血进行抗体检测。而血清样本在采集过程中则特别注意避免产生溶血，因为这会增加ELISA检测抗体时的假阳性率。

2.2 备选样本

在对野猪感染ASFV情况的日常监测中，研究人员常无法取得新鲜的血液样本，因此尝试使用干血斑、干燥的血液拭子、粪便、器官与组织以及唾液等其他替代样本进行抗体检测。RANDRIAMPARANY等[22]于2016年报道将在野外环境下采集到的少量血液滴加到干燥的Whatman 3-MM滤纸上，风干数小时后将滤纸放入含有干燥剂的塑料样本袋中，此样本即为干血斑。使用ELISA检测干血斑发现其敏感性与全血或者血清样本基本一致。CARLSON等[23]使用干燥的血液拭子样本进行ASFV抗体检测，发现相对于血液样本其敏感性为93.1%，特异性为100%。随后，CARLSON等[23]进一步评估了用干燥的血液拭子检测ASFV抗体的情况，其试验结果与之前研究结果一致。NIETO-PELEGRN等[24]使用真核表达系统表达的p72蛋白和p30蛋白作为包被原，对人工感染ASFV猪的粪便样本进行ELISA检测，结果发现使用粪便样本和血液样本得到的结果基本一致，但是粪便样品中抗体稳定性高度依赖于温度，即温度越低，稳定性越好。在使用器官与组织样本方面，选用淋巴结、脾脏、肺脏和肝脏等器官中提取的渗出物作为检测样本，通过IPT进行抗体检测，能获得比ELISA更灵敏的结果[25]。在使用唾液样本方面，MUR等[26]首次对比了人工感染弱毒ASFV的猪在感染后不同时间点的血液样本和唾液样本中ASFV特异抗体的含量变化，结果发现，相对于感染后8～11 d血液中开始出现特异性抗体，唾液样本中出现特异抗体的时间在感染后11～30 d，2种样本中抗体量的变化基本一致。当血液样本中ASFV特异性抗体滴度低于1∶2 500时，唾液中检测不到特异性抗体存在。GIMÉNEZ-LIROLA等[27]建立了基于原核表达的p30蛋白作为包被原的检测血液和唾液样本中ASFV特异性抗体的间接ELISA方法，发现对于不同来源的血液和唾液样本其检测结果基本一致，同时使用该方法可在感染后8 d的唾液样本中检测到特异抗体。

3 非洲猪瘟病毒特异性抗体相应检测靶标研究

3.1 非洲猪瘟病毒特异性抗体检测常用靶标

3.1.1 p72蛋白 p72蛋白是最早被证明在自然感染中能够引发抗体产生的ASFV蛋白[28]。BAO等[29]对27个ASFV毒株的全基因组进行变异性分析发现，p72蛋白的保守性较高，可作为稳定的检测靶点。MALLORY等[30]通过杆状病毒表达p72蛋白片段(氨基酸位点20～303)制备了识别ASFV的p72蛋白单克隆抗体，为开发ASFV抗体新检测方法提供了可能。西班牙INGENASA公司开发了基于p72蛋白的竞争性ELISA检测试剂盒及侧向流层析检测试剂盒(以下简称商品化试剂盒)。林彦星等[31]合成p72蛋白的抗原表位优势肽段，并将其与牛血清白蛋白进行偶联，建立了检测p72蛋白抗体的量子点免疫层析试纸检测方法。郭晶等[32]使用毕赤酵母表达的重组p72多表位融合蛋白作为包被抗原建立的检测ASFV抗体间接ELISA方法特异性和敏感性良好。朱家宏[33]用抗p72蛋白的纳米抗体建立的竞争ELISA检测方法，敏感性为93.3%，特异性为97.1%，与商品化试剂盒的符合率达到96.3%。张蕾等[34]选用人工合成肽(包括p72蛋白)作为包被原建立的间接ELISA抗体检测方法，敏感性为91.4%，特异性为98.1%，与商品化试剂盒的符合率达到92.9%。庚辛等[35]使用原核表达的p72蛋白建立了检测ASFV特异性抗体的间接ELISA方法，结果显示，该方法可以检测出稀释度为1∶3 200的ASFV阳性血清，试剂盒检测敏感性为100%，特异性为98.70%，总符合率为98.91%。王彩霞等[36]以真核表达的p72蛋白作为包被抗原、以抗p72蛋白的特异性单克隆抗体作为检测抗体建立的特异性检测ASFV抗体阻断ELISA方法具有较高的特异性、敏感性以及良好的重复性，最低能检测出稀释度1∶128的ASFV阳性血清，与商品化试剂盒的符合率达到100%。

3.1.2 p54蛋白 曹琛福等[37]用原核表达的p54蛋白作为包被原建立的竞争ELISA检测方法，特异性为100%，敏感性为96.22%，与商品化试剂盒符合率达到98.13%。TESFAGABER等[38]原核表达了p54蛋白并制备了特异性单抗，建立了基于单克隆抗体的竞争性酶联免疫吸附试验(cELISA)，该方法敏感性为92.5%，特异性为98.9%。

KAZAKOVA等[42]以原核表达的俄罗斯流行株Stavropol 2008的p30蛋白中部亲水片段为基础建立的免疫印迹抗体检测方法，特异性为98.75%，敏感性为100%。吴竞等[43]用原核表达的p30蛋白作为包被原建立的间接ELISA检测方法，特异性良好，对阳性猪血清灵敏度可达1∶1 600。孙燕燕等[44]使用金纳米颗粒标记原核表达的p30蛋白作为检测探针，制备了检测试纸，与商品化试剂盒作比对，敏感性为95.52%，特异性为92%。徐黎晖等[45]使用昆虫杆状病毒表达系统表达了ASFV的p30蛋白，纯化后将其作为包被原建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法，可检测到稀释度为1:128的ASFV阳性血清，与商品化试剂盒相比符合率为98.9%。荣明轩等[46]使用不带组氨酸标签的p30蛋白建立的检测ASFV特异性抗体的间接ELISA方法，在检测临床样本时可有效消除带有组氨酸标签的基因工程疫苗免疫后所造成的假阳性反应。ZHANG等[47]针对p30蛋白制备了单克隆抗体，利用这些单克隆抗体研制了用于ASFV快速检测的信号放大胶体金试纸条，检出限为2.16 ng。

3.1.4 pp62蛋白 pp62蛋白作为蛋白前体，在病毒粒子成熟的过程中被蛋白酶pS273R切割为p35蛋白、p15蛋白和p8蛋白共3个结构蛋白[48]。研究表明，p15蛋白是pp62蛋白产生抗原性的主要成熟蛋白[41]。GALLARDO等[49]建立了基于pp62重组蛋白(昆虫杆状病毒表达系统)的ELISA检测方法，通过检测425份田间猪血清样本和253份状态不佳的田间样本(37 ℃放置30 d)，发现其敏感性和特异性均优于OIE推荐的使用易感细胞培养的全病毒作为包被原建立的ELISA方法。

3.1.5 pB602L蛋白 IRUSTA等[50]发现，使用ASFV的康复猪血清能与大肠杆菌表达的pB602L蛋白发生较强反应。王鹏飞[51]用原核表达的pB602蛋白建立了间接ELISA法检测ASFV特异性抗体，与商品化试剂盒检测结果相比符合率为95%。

3.1.6 pK205R蛋白 邬旭龙等[52]用原核表达的pK205R蛋白作为包被原建立的间接ELISA检测方法，特异性良好，对阳性猪血清灵敏度可达1∶2 560，与商品化试剂盒符合率为100%。肖景景等[53]用原核系统表达了K205R蛋白，并将其作为抗原建立了ELISA抗体检测方法，与商品化试剂盒符合率为98.3%。

3.1.7 pA104R蛋白 王兆贵等[54]利用原核表达的pA104R蛋白作为抗原，建立了ASFV抗体检测间接ELISA方法，该方法的敏感性和特异性分别为97.2%和97.4%，与商品化试剂盒符合率为94.7%。

3.2 非洲猪瘟病毒检测靶标筛选及其应用

不同ASFV毒株之间基因组大小不同，所编码的开放阅读框(open reading frame，ORF)在151～167个位点之间[4]。ALEJO等[48]用质谱技术对ASFV的病毒粒子进行分析，共鉴定到68种丰度较高的蛋白质，其中44个蛋白质是新发现的，而且新发现的蛋白中50%左右功能未知。KOLLNBERGER等[55]率先使用康复猪血清筛选了Ba71V毒株的cDNA文库，鉴定到14个由病毒感染所引发的能产生抗体反应的病毒蛋白质，即p30蛋白(CP204L)、p54蛋白(E183L)、p72蛋白(B646L)、A104R蛋白、p10(K78R)蛋白、F334L蛋白、K196R蛋白、NP419L蛋白、B602L蛋白、C44L蛋白、CP312R蛋白、K145R蛋白、E184L蛋白和K205R蛋白。

REIS等[56]使用感染弱毒株NH/P68后不同时间点采集的猪血清来评估前面提到的14个病毒蛋白中除K145R蛋白和E184L蛋白以外的剩余12个病毒蛋白所引发的IgG1、IgG2和IgM反应强度，结果发现，p54蛋白、pK205R蛋白、pA104R蛋白和pB602L蛋白能引发强的IgG应答，使用pK205R蛋白能在感染早期敏感地检测到IgM反应。通过进一步比较无症状感染猪和慢性感染猪对于这12个蛋白的IgG反应差异发现，在慢性感染组中针对pNP419L蛋白、pCP312R蛋白、p72蛋白、pK196R蛋白和pK205R蛋白的抗体滴度显著高于无症状组，而针对pA104R蛋白的抗体滴度在无症状感染组中更高。使用p54蛋白、pK205R蛋白、pA104R蛋白和pB602 L蛋白既能检测到IgG反应又能检测到IgM。GALLARDO等[57]用原核系统表达的这4种蛋白建立了ELISA抗体检测方法，研究发现与OIE推荐的方法相比较，用p54蛋白和pK205R蛋白和pB602L蛋白作为包被原检测效果更好；单独使用pA104R蛋白灵敏度与OIE推荐的方法基本一致。CAPPAI等[58]于2017年使用商品化试剂盒检测了113份野猪的血液和肺脏样本，发现该试剂盒敏感性为81.8%，特异性为95.9%。该试剂盒检测的靶标是针对p72蛋白的抗体，是目前在欧盟广泛使用的试剂盒[59]。

总之，目前商品化ASFV抗体检测试剂盒常用的检测靶标为p30蛋白、p62蛋白、p72蛋白等(表1)。除了上述常见靶标，中国国内的多个研究团队将p35蛋白[60]、pA104R蛋白[61]、D1133L蛋白[62]、EP364R蛋白[63]和K145R蛋白[64]作为靶标建立ASFV抗体检测的ELISA方法，取得了敏感、特异的检测效果。

表1 商品化非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒常用检测靶标Table 1 The common detection targets of commercial kit of African swine fever virus antibody detection

4 非洲猪瘟病毒抗体检测的主要检测方法

目前，ASFV抗体检测以血清学检测为主，常用的方法有ELISA[19]、IB、IFA和IPT[20]。OIE推荐使用ELISA作为抗体筛选试验，IB、IFA、IPT作为确认试验，4种检测方法各自特点见表2。

表2 非洲猪瘟病毒抗体检测4种检测方法的比较Table 2 Comparison of 4 detective methods of detecting antibody to African swine fever virus

5 非洲猪瘟病毒抗体检测的未来发展方向

ASFV抗体检测主要应用在猪群的健康监测方面，因此更加灵敏、快速和低成本是开发新抗体检测方法的发展方向。目前，市场上的实时、快速的ASFV抗体检测产品主要为定性产品，以基于膜的金标层析为主，近年来中国国内也有多个课题组制备了胶体金免疫层析试纸和量子点免疫层析试纸，为以后现场快速检测提供技术储备[31,44,65]。免疫层析试纸在灵敏、快速和低成本上具有不可比拟的优势，但是也存在定量检测受限和敏感性稍低的缺点[66]。因此，将来的研究可以在以下4个方面加以改进：

(1)由于IgM比IgG出现更早，因此在抗原选择上可以加入pK205R蛋白，再加上IgG反应较强的若干个蛋白，推测可以达到更快、更灵敏的检测效果。(2)采用更加敏感的新型纳米材料如磁性纳米颗粒、荧光微球、量子点等作为标记物。(3)利用更加精密的试纸信号读取设备，增加比色卡进行粗略半定量或者配备读数仪，对反应曲线判读获得定量结果。(4) “半自动定量”，除加样外，其他步骤均实现半自动或全自动定量检测。

毋庸置疑，即时、即地、精准、快速、自动化将是未来ASFV抗体检测技术的发展方向，配套的检测仪器、设备也日渐倾向于微型化、便携化。