白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟碳氮代谢及硝酸盐含量的影响

李耕，冯雨晴，赵园园，刘德水，周骏，史宏志

(1.河南农业大学烟草学院，河南 郑州450002；2.上海烟草集团有限责任公司北京卷烟厂，北京 100024)

白肋烟是混合型卷烟的重要原料，其种植面积和产量仅次于烤烟。白肋烟是一种Yellow Burley (Yb) 基因突变体，因其叶片本身色素含量较低，导致光合作用下降，从而不能为叶片氮还原同化过程提供充足能量，造成叶片中的硝酸盐大量积累[1-2]。硝酸盐作为烟草特有亚硝胺(tobacco specific nitrosamines,TSNAs)的重要前体物，与后期烟草叶片TSNAs形成密切相关，而TSNAs是一类存在于烟叶和烟草制品中的有害化合物，对人体健康有很大危害。硝酸盐的积累与烟草碳代谢和氮代谢密切相关，氮代谢需要依赖碳代谢提供碳源和能量，而碳代谢又需要氮代谢提供酶蛋白和光合色素，二者需要共同的还原力、三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)和碳骨架[3]。目前，有关施氮量[4]、打顶时间[4]、氮素形态[5]和外源调控剂[6-7]对白肋烟硝酸盐含量的影响已有较多研究，但通过嫁接的方法用氮效率显著高于白肋烟的烤烟品种作砧木来探讨对白肋烟碳氮代谢和硝酸盐含量影响的研究比较鲜见。

嫁接是植物无性繁殖的一种栽培技术，且嫁接苗砧木和接穗中的遗传物质不会改变。许多研究表明，砧木可以对接穗的生长发育[8]、生理生化特性[9]、产量和品质[10]以及植物抗性[11]等方面产生影响。王磊等[9]研究表明，强壮砧木与接穗嫁接后，植株叶片色素含量、光合作用、氮代谢酶活性和氮含量均高于自根苗。同时，嫁接还会影响植株呼吸、营养元素代谢和内源激素含量等生理生化过程[12-13]。氮素是植物生长所必需的大量元素之一。袁亭亭等[14]研究表明,嫁接对植株氮素吸收利用效率的调控最为明显。RUIZ等[15]研究发现，选择不同氮效率的烤烟品种进行嫁接是提高烟草氮素利用效率的一种快速而有效的方式。此外，适宜砧木嫁接可以改善接穗叶片氮代谢关键酶活性，提高叶片氮素同化能力[16-17]。由此可见,植株叶片的碳氮同化能力因嫁接根系改变而发生显著变化。白肋烟和烤烟是烟草的2种类型，其氮效率和烟叶硝态氮含量差异很大，生产中白肋烟比烤烟施氮量高4倍之多，烟叶硝态氮含量比烤烟高10倍以上[18]。鉴于此，本试验以烤烟中有代表性的品种K 326和白肋烟中有代表性的品种鄂烟1号为材料进行嫁接处理，研究嫁接对白肋烟生长发育、色素含量、光合作用及碳氮代谢能力的影响,为通过农业措施降低和调节烟叶硝酸盐含量提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料及培育条件

试验在河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地气候室进行。气候室条件设置：温度为22～28 ℃，每12 h昼夜交叉光照(白天时间段设置为8：00—20：00)，光照400 μmol·m-2·s-1。以白肋烟品种鄂烟1号和烤烟品种K 326为材料。采用漂浮育苗方式育苗，2019-09-25烤烟K 326开始育苗，为增加嫁接苗成活率，砧木要比接穗提前7 d育苗，白肋烟鄂烟1号于2019-10-02开始育苗，烟苗长至大十字期时进行剪叶促进烟苗生长，待烟苗长至5～6片叶(苗龄45 d左右)时开始进行控水处理，以增强烟苗柔韧性，采用MS培养基配制营养液。

1.2 试验设计

2019-11-15挑选长势均匀，大小一致的烟苗采用劈接法进行嫁接。试验设置3个处理，处理1:接穗与砧木都为K 326,用“F/F”表示;处理2:接穗与砧木都为鄂烟1号,用“B/B”表示;处理3:鄂烟1号为接穗,K 326为砧木，用“B/F”表示。当嫁接苗出现新生的真叶时开始将其移栽至填满营养土的花盆中，1株·盆-1。移栽21 d后开始取样测定生理指标和常规化学成分，每个处理10棵烟，共30棵。

1.3 测定项目和方法

1.3.1 光合测定 选取各处理长势均匀一致的烟苗，采用便携式光合测定仪(LI-6400，美国Licor公司)测定净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间二氧化碳摩尔系数(Ci)。光合仪器设置为开放通路 (手动进行)，红蓝光源外接光源光照度设为800 μmol·m-2·s-1，每棵烟所测叶片用外接光源照射15 min，使其光合速率达到稳定状态，测定时间选择9:00—12:00和14:00—17:00，测定部位选择烟苗最大功能叶(从下向上，第3叶位)进行测定。每个处理重复测定3次。

1.3.2 生物量积累测定 挑选不同处理的烟将其根、茎、叶进行分离，称其鲜质量后，将其根、茎和叶片在烘箱中 105 ℃杀青20 min，60 ℃烘干，称其干质量后磨碎，过0.25 mm筛子，用于后续化学成分测定。

1.4 数据分析

釆用Excel和GraphPad Prism(V.5.01,GraphPad Software Inc.,CA USA)软件进行数据整理和图形的绘制，采用DPS 7.05软件和LSD法，对不同处理间烟叶色素含量、硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)和谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)活性、蛋白质含量、总氮、铵态氮和硝态氮含量等指标进行多重比较和方差齐性检验。

2 结果与分析

2.1 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶生物量的影响

表1显示，烟草不同砧穗组合嫁接苗生物量存在显著差异,且3种嫁接苗根、茎、叶鲜质量和干质量均表现为F/F>B/F>B/B。其中，B/F处理的根、茎、叶鲜质量分别较B/B处理升高20.00%,20.49%和14.34%，根、茎、叶干质量分别较B/B处理升高50.00%,22.58%和15.57%。F/F处理的根、茎、叶鲜质量分别较B/B处理升高40.00%,26.01%和22.18%，根、茎、叶干质量分别较B/B处理升高75.00%,51.61%和26.23%。

表1 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶生物量的影响Table 1 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on tobacco leaf biomass g

2.2 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶色素含量的影响

由图1可知，砧木显著影响了嫁接烟叶色素含量，以烤烟为砧木嫁接后，3种嫁接苗间的色素含量有明显差异，且叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和色素总含量均表现为F/F>B/F>B/B。其中，与B/B处理相比，B/F处理的烟叶叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和色素总含量分别增加13.61%,14.44%，25.62%和15.45%。与B/B处理相比，F/F处理的烟叶叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和色素总含量分别增加20.17%，22.43%，48.38%和25.44%。白肋烟是叶色黄绿突变的烟草，色素含量较低，而以烤烟为砧木能够显著提升白肋烟接穗叶绿素含量，可能与上述烤烟根系生物量高，从而能吸收更多氮素有关。

2.3 白肋烟和烤烟嫁接对烟苗光合参数的影响

由图2可知，以烤烟为砧木嫁接后，不同处理间Pn，Tr，Gs和Ci均表现为F/F>B/F>B/B，且B/F处理和F/F处理之间无显著差异。其中，B/B处理烟苗Pn和Tr显著低于F/F处理，而以烤烟K 326为砧木进行嫁接后，B/F处理烟苗Pn和Tr分别较B/B处理增加21.89%和17.76%。表明砧木对接穗光合性能有较大影响，尤其对净光合速率的影响最大。

2.4 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶总糖和还原糖含量的影响

由图3可知，以烤烟为砧木嫁接后，3种嫁接苗间总糖和还原糖含量均表现为F/F>B/F>B/B，差异达显著或极显著水平。其中，与B/B处理相比，B/F处理的烟叶中总糖和还原糖含量分别升高21.05%和79.44%。与B/B处理相比，F/F处理的烟叶中总糖和还原糖含量分别升高42.66%和93.33%。因此，以烤烟为砧木能促进白肋烟接穗碳水化合物合成，从而为烟叶硝酸盐还原同化提供充足碳源。

图1 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶色素含量的影响 Fig.1 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on the pigment content of tobacco leaves

图2 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟苗光合参数的影响 Fig.2 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on photosynthesis parameters of tobacco seedlings

图3 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶总糖和还原糖含量的影响 Fig.3 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on the content of total sugar and reducing sugar in tobacco leaves

2.5 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶氮代谢酶活性和含氮化合物含量的影响

图4 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶氮代谢酶活性和含氮化合物含量的影响 Fig.4 Effect of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on the activities of nitrogen metabolism enzymes and the contents of nitrogen compounds of tobacco leaves

2.6 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶氮素积累的影响

由表2可知，3个嫁接苗氮素积累特点不同。以烤烟为砧木嫁接后，在根、茎中总氮含量大小分别为F/F>B/F>B/B。与B/B处理相比，B/F处理的根、茎总氮含量提高了11.02%和6.23% ，F/F处理的根、茎总氮含量提高了16.27%和11.53%。B/B处理的烟苗叶片总氮含量较高，较F/F处理和B/F处理分别高9.02%和2.34%，但叶片氮素积累量相对较低，这与其叶片干物质积累量较低密切相关；而B/F处理和F/F处理的烟苗叶片总氮含量较低，但叶片氮素积累量较高，分别较B/B处理高15.92%和13.17%，这与该处理叶片干物质积累量较高有关。说明以烤烟为砧木有利于促进白肋烟叶片中干物质积累。

表2 白肋烟和烤烟嫁接对白肋烟烟叶氮素积累的影响Table 2 Effects of burley tobacco and flue-cured tobacco grafting on nitrogen accumulation of tobacco leaves

3 结论与讨论

采用不同砧木嫁接苗对比试验,发现其植株生长发育因嫁接砧木的不同而表现显著差异[25]。本研究通过对F/F，B/B和B/F嫁接的对比发现，植株根、茎、叶鲜质量和干质量均表现为F/F>B/F>B/B，表明了烤烟K 326砧木发达的根系对嫁接苗生长具有显著促进效果。同时，嫁接砧木还会影响植株光合特性[26]。王磊等[9]研究表明，与接穗自根嫁接苗相比，长势较强砧木嫁接组合色素、光合速率和叶片总氮含量分别升高8.46%，23.13%和16.21%。不同砧木嫁接苗的差异可能与砧木根系紧密相关,强壮根系砧木因其较强吸肥吸水能力导致植株体内元素和水分状况较好[27-28],从而有利于植株叶片叶绿素的合成及光合能力的提高[29]。此外,也有研究表明,嫁接显著影响植株叶片及伤流液中内源激素含量，进而调控植株叶片的光合能力[30-31]。本试验结果表明，B/B处理的烟株色素含量和光合作用显著低于F/F处理，而以烤烟为砧木嫁接后，B/F处理的烟株色素和光合作用高于B/B处理。叶绿素与氮素具有较好的相关性，本试验中B/F处理的烟株根、茎、叶氮素积累量均高于B/B处理，可能因此导致B/F处理的烟株色素含量和光合作用高于B/B处理。此外，烤烟砧木是否改变了白肋烟接穗中的内源激素含量,从而导致其色素和光合作用的变化，有待进一步研究。