广西某金属冶炼厂工人镉暴露与认知相关基因甲基化的关联

刘秋梅，喻国旗，张志勇，2a，农春涛，蔡建升，2b，徐敏，张君玲，许霞，刘淑珍，韦春梅，覃健

1.广西医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室，广西 南宁 530021

2.桂林医学院 a.公共卫生学院环境卫生与职业医学教研室 b.广西肿瘤免疫与微环境调控重点实验室，广西 桂林 541199

镉是在蓄电池、电镀、电器制造等生产领域中广泛使用的有毒金属，可诱发神经毒性［1］。Hart 等［2］率先发现职业镉暴露可导致工人认知功能的损伤。人群研究表明，高浓度镉暴露与老年人［3］及儿童［4］的认知功能呈负相关。镉暴露还可增加职业工人阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）的发病风险［5］。动物实验也提示，镉的持续暴露会损害C57BL/6 雄性小鼠的认知及嗅觉记忆［6］。然而在最近的一项研究中，使用来自AD患者和无痴呆的老年对照的死后脑样本，AD病例的额叶皮层中的镉浓度低于对照［7］，Przybyla等［8］也未发现镉暴露与认知功能有关联。故关于镉暴露与认知功能的关联性，不同研究结果存在异质性，仍需开展更多的研究。

金属暴露对健康的作用可能与表观遗传改变有关，而DNA 甲基化可能在其中发挥重要作用。既往研究发现KL（klotho）、脑源性神经营养因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）、淀粉样蛋白前体（amyloid protein precursor，APP）基因是神经功能发育、修复、退行性变等过程的重要调节基因。KL基因是重要的抗衰老基因［9］，其过表达可有效改善小鼠的认知缺陷和AD 样病理改变［10］，而KL基因敲除小鼠则会出现记忆功能障碍、海马神经退行性变等［11］。BDNF是一种认知相关蛋白，对神经元的生长、发育和维持起保护作用。Meta分析结果显示AD病人的BDNF水平低于健康人群［12］。APP衍生的C端片段（APP-CTF）的积累会触发过量线粒体形态的改变，缺陷的线粒体在AD 的发病机制起重要作用［13］。大量研究表明，基因甲基化在重金属暴露致躯体功能损害过程中的作用不容忽视。本研究拟通过对广西某冶炼厂职工展开流行病学研究，探索不同镉暴露水平与认知相关基因甲基化之间的关联性，为重金属职业暴露者的健康防护提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

所有研究对象均来自广西某金属冶炼厂工人，参与2017年职业体检，并完成一般情况问卷调查及血样、尿样的采集。体检资料纳入标准：（1）工龄≥3月的18～60 岁职工；（2）无其他职业危害因素接触史，如苯、一氧化碳等；（3）身体系统无明显疾病；（4）所有研究对象均愿意参加本项目并知情同意。排除标准为：（1）问卷资料不全；（2）确诊神经官能症患者；（3）尿铅（urinary lead，UPb）浓度超标（前期抽检发现镉和铅为该厂工人主要重金属暴露）。共有1 010名工人的资料符合标准，对他们进行尿镉（urinary cadmium，UCd）、UPb、尿肌酐测定，并根据尿肌酐校正后的UCd水平（＜P25，P25～P75，＞P75）将1 010 名工人分为低、中、高暴露组，各暴露组工人按年龄、性别进行分层，采用频数匹配法从各暴露组随机抽取各150 例样本进行甲基化水平测定，最终纳入分析的共有450 例研究对象。

本次研究获得广西医科大学伦理委员会的批准（批准号：20160302-11），所有参与研究的职工均在受检之前签署了知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 调查内容由经过培训的调查员采用统一设计的调查问卷对受访对象进行面对面调查，收集包括基本人口学特征、生活行为习惯（饮酒、吸烟）、工龄、职业暴露史等资料。过去30 d 中，至少饮过半瓶啤酒/2.5 两葡萄酒或果酒/0.8 两白酒（1 两等于50 g）视为饮酒；每天吸烟1 支及以上，连续或累积≥6 个月视为吸烟。

1.2.2 血液、尿液样本采集抽取研究对象空腹静脉血15 mL，用于血生化检测及DNA 提取等。剩余样本置于-80℃低温冰箱冻存，以备后续检测。留取受检者中段尿样约20 mL，于4℃保存，待后续测定。

1.2.3 UCd、UPb、尿肌酐水平检测研究对象UCd、UPb 水平的检测采用石墨炉原子吸收光谱法（岛津AA-6300C，日本），具体操作方法参照文献［14］。低于检出限水平的值以检出限/ 代替。尿肌酐水平的测定采用96 微孔板肌氨酸氧化酶法（南京建成，中国）。最终纳入分析的UCd、UPb 水平均为经尿肌酐调整后的水平。

1.2.4 KL、BDNF、APP基因甲基化水平检测对450例抽样人群进行外周血基因组DNA 的提取；随后利用MethylTarget 技术，结合多重PCR 进行测序，检测KL、BDNF、APP基因各CpG 位点的甲基化水平。利用软件（http://primer3.ut.ee/）进行引物设计、序列比对及CpG岛分析等。相关引物详见表1。

表1 目的基因甲基化特异性引物序列Table 1 Specific primer sequences of target gene methylation

1.3 质量控制

所有调查员经过统一培训，严格按照调查标准进行。生物样本采集后迅速放入4℃冷藏箱内。使用EpiData 软件进行数据的双人双录入。UCd、UPb 水平测定时，每间隔15 个样本测定一次镉、铅标准品浓度进行质控，并将平行样的变异度控制在5%以内；加标回收率控制在80%～120%。此外，尿肌酐测定设置5次平行样检测，相对标准偏差控制在5%以内。

1.4 统计学分析

所有分析均在SPSS 23.0、R 4.0.2 中完成。将UCd水平进行常用对数（lg）转换纳入样条分析。计数资料用率表示，组间比较采用卡方检验；正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间差异采用单因素方差分析，事后两两比较采用LSD；不服从正态性的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Kruskal-WallisH检验。限制性立方样条分析用于探索UCd与基因甲基化水平的暴露-效应关系。通过Mann-WhitneyU检验分析各暴露组两组之间特定基因CpG位点甲基化水平的差异。双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 研究对象的基本情况

本研究最终纳入450名研究对象，包含377名男性（83.78%）和73 名女性（16.22%），年龄为（38.88±6.87）岁，尿镉水平的M（P25，P75）为2.73（1.04，5.75）μg·g-1（经尿肌酐校正，后同），UCd 水平在低、中、高暴露组间差异有统计学意义（P＜0.001）。研究对象多数为己婚或再婚（90.89%），初中及以下文化程度占半数以上（62.00%），婚姻状况及文化程度存在组间差异（P＜0.05）。性别、年龄、民族、饮酒、吸烟情况、工龄及体重指数（body mass index，BMI）在各暴露组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各暴露组研究对象的基本情况［例数（构成比/%）］Table 2 Characteristics of study subjects with different levels of cadmium exposure [n (proportion/%)]

2.2 不同镉暴露组间APP、BDNF、KL 基因甲基化率的比较

APP、BDNF、KL三个基因平均甲基化率分别为（1.52±0.34）%、（4.55±1.08）%、（2.34±0.39）%。APP基因04 片段、KL基因及其02 片段的甲基化率在各暴露组组间存在差异（P＜0.05）。APP基因04 片段在低、中暴露组间比较有差异，中暴露组甲基化水平较低（P＜0.05）；而KL基因及其02 片段平均甲基化率在低暴露组分别与中、高暴露组之间比较均有差异（P＜0.05），中、高暴露组甲基化率低于低暴露组。见表3。

表3 不同暴露组间各目的基因甲基化率比较Table 3 Comparison of gene methylation rates between different exposure groups单位（Unit）：%

2.3 UCd水平与KL 基因甲基化率的暴露-效应关系

组间比较显示KL基因低-中、低-高暴露组比较均有差异，限制性立方样条分析UCd 水平（常用对数lg 转换）与KL基因甲基化水平的暴露-效应关系，结果显示，调整婚姻状况、文化程度后，UCd 水平与KL基因甲基化水平呈负相关（P=0.035），并且存在线性暴露-效应关系（图1），随着UCd 水平升高，KL基因甲基化水平降低。

图1 镉暴露水平与KL 基因甲基化水平相关性的限制性立方样条图Figure 1 Restricted cubic spline plot of the correlation between urinary cadmium levels and KL gene methylation rate

2.4 不同暴露组间基因CpG 位点甲基化水平分析

采用Mann-WhitneyU检验进行KL、APP、BDNF三个目的基因的CpG 位点的组间比较。表4仅列出差异具有统计学意义的CpG 位点、组间甲基化差异程度及其P值。低暴露组与中暴露组比较，随着暴露浓度的增加，三个目的基因的CpG 位点改变具有统计学意义的位点个数分别为：APP基因2 个，BDNF基因7 个，KL基因5 个（均P＜0.05）。中、高暴露组间比较，APP基因在共有3 个CpG 位点存在差异，KL基因2个，BDNF基因5 个；低暴露组与高暴露组比较，APP、KL基因CpG 位点平均甲基化水平存在差异共3 个（P＜0.05），而BDNF基因的CpG 位点甲基化水平在低、高暴露组间差异无统计学意义。

表4 不同基因CpG 位点平均甲基化率的组间比较Table 4 Comparison of average methylation rates of CpG loci of selected genes between different exposure groups

3 讨论

镉暴露引起机体认知功能损伤的确切机制尚不清楚。本研究通过对职业镉暴露人群认知相关基因的甲基化研究，结果发现低、中浓度尿镉暴露可能与KL、APP基因甲基化率降低有关。方差分析显示KL基因平均甲基化水平在低-中、低-高暴露组间存在差异，限制性立方样条提示镉暴露与KL基因甲基化率呈负相关。Guan 等［15］发现镉处理可降低果蝇39 个基因甲基化水平，这些基因与发育、繁殖和能量代谢有关。同时有研究发现宫内镉暴露可致新生儿基因出现全基因组低甲基化现象［16］。KL基因主要在脉络丛和神经元细胞中高表达，与神经退行性疾病相关，镉暴露引起该基因甲基化水平降低可能导致海马退行性变，进而损伤认知功能。动物研究发现KL高表达小鼠表现出更好的认知功能［17］。金属镉暴露与KL基因甲基化的关系及其对认知功能的影响有待进一步研究。

镉、铅联合暴露致雄性大鼠中海马和皮质中淀粉样蛋白的产生，介导了APP的表达［18］。Hou等［19］观察到AD患者的APP基因整体甲基化水平低于正常人群，且其表达水平与AD 病情严重程度呈正相关。本研究对职业人群镉暴露与APP基因甲基化水平的关联性进行首次探讨，结果显示低镉暴露组APP基因04片段的平均甲基化率高于其他两个暴露水平，与中暴露组比较有差异。该结果支持了镉暴露与APP基因甲基化的关联性，即低浓度的镉暴露可引起APP基因去甲基化从而改变转录并诱导APP基因过表达，进而增加了淀粉样蛋白的产生并在认知功能障碍和AD 发病机制中起重要作用，需要进一步研究以探索其相关机制。

本研究结果显示不同暴露组间BDNF甲基化水平无差异。目前关于镉或其他重金属暴露与BDNF基因的甲基化水平的关联性研究较少。在一项移民孕妇研究中发现，孕早期重金属Pb、Hg、Cd 暴露与BDNF浓度之间无相关性［20］。研究表明，锰暴露可降低职业工人血浆BDNF水平和认知能力［21］。BDNF基因的甲基化状态，尤其是其启动子区域的甲基化状态，是与精神疾病有关的最重要参数之一［22］，在男性精神分裂症患者中发现BDNF启动子甲基化水平更高。海马中BDNF基因外显子IX 的DNA 甲基化增加进而引起BDNFmRNA的表达下降，是影响大鼠及其后代的学习记忆障碍和认知障碍的重要原因之一［23］。由于本研究样本量较少，因此，需要更大样本量的进一步研究来确认二者的关联性及其对认知功能的影响。

本研究的优势在于对重金属镉与3 个基因甲基化水平的关联性进行探讨，但仍有部分局限性：首先，作为金属暴露与相关基因甲基化的关联性探讨，本研究纳入样本量较少，差异具有统计学意义的CpG 位点的相关性有待进一步功能性验证；另外，本次调查仅针对广西某冶炼厂职工，对于其他职业性金属镉暴露高危人群以及普通人群外推性较弱。

综上，镉暴露可能与KL、APP基因低甲基化率有关，KL基因甲基化率与UCd 水平呈负相关。