4种原核表达双链RNA的dsRNA提取方法效果评价

2021-11-02付开赟廖兰兰丁新华郭文超吐尔逊阿合买提

新疆农业科学 2021年4期

常瑞，王俊，付开赟，廖兰兰，丁新华，何江，郭文超，吐尔逊·阿合买提，任羽

(1.喀什大学生命与地理科学学院，新疆喀什 844006；2.新疆农业农村厅植物保护站，乌鲁木齐 830049；3.新疆农业科学院植物保护研究所/农业部西北荒漠化绿洲作物有害生物综合治理重点实验室，乌鲁木齐 830091；4.新疆农业科学院微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物重点实验室，乌鲁木齐 830091)

0 引言

【研究意义】马铃薯甲虫(LeptinotarsadecemlineataSay)是马铃薯毁灭性害虫。持续化学防治使马铃薯甲虫对部分拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机磷、新烟碱类和微生物杀虫剂产生了抗性[1]。使用RNAi技术，喂食马铃薯甲虫涂抹dsRNA的马铃薯叶片，可有效降低、沉默马铃薯甲虫特定基因表达，抑制马铃薯甲虫的正常生长发育，具有高度专一性、安全性强，且植物生长发育不受影响，对挖掘更多生物防治策略具有重要意义[2]。但dsRNA生产成本高、产量无法预测、稳定性低。【前人研究进展】dsRNA在环境中极不稳定，自然条件下3～5 h就会完全降解；San等[3]发现dsRNA在紫外线照射下，4 h就会完全降解。并且其作用机制研究不系统，植物是否会传递、扩增dsRNA以及有害生物对RNAi敏感性差别大等因素[4]。目前，dsRNA主要通过3个方法大量生产：一是合成含有T7启动子的dsRNA特异性引物，运用体外合成试剂盒合成dsRNA[5,6]。二是原核生物发酵生产dsRNA，最早用于干扰秀丽引线虫,喂食秀丽引线虫时可产生强烈干扰。将构建完成的dsRNA表达载体导入RNase III缺陷型大肠杆菌HT115(DE3)感受态中，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，产生dsRNA[7,8]。三是通过转基因植物表达dsRNA，使植物具有“终生”防御性，害虫啃食植物后，可有效抑制其生长发育甚至直接死亡，无需人为干预[9,10]。【本研究切入点】方法可大量合成dsRNA，快速高效，合成dsRNA可直接使用，但体外合成试剂盒成本较高，实际大规模推广使用不切实际。方法可发酵得到大量dsRNA，且成本较低。但在发酵、诱导过程中，如何保证菌体高活性、持续产生dsRNA，仍需有待研究。针对RNAi的特异性以及原核发酵获得dsRNA良好的应用前景，以pET-2p和L4440为载体发酵产生dsRNA的实验方法为基础。研究筛选并试验4种提取菌液总RNA方法以提高菌液dsRNA的获取率。【拟解决的关键问题】利用720 bp绿色荧光蛋白gfp[11-13]为模板，分别随机改变碱基改变GC含量，并构建5组不同长度组合的dsgfp片段：201 bp长度的30%CG 含量的dsgfp(简称201-30CG，下同)、201-50CG、423-30CG、423-50CG、423-70CG。运用试剂盒体外合成以上5种dsgfp，检测其浓度、纯度作为参照标准。将以上10组表达载体原核发酵后，运用Trizol法、酚氯仿法、RNA-easy提取液、以及75%酒精沉淀法分别提取dsgfp。建立菌液表达dsRNA的最佳提取方法以及最优表达载体提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体

pET-2p、L4440质粒实验室保存。

1.1.2 菌株

大肠杆菌HT115(DE3)菌株购自上海唯地生物技术有限公司，培养至二代菌株由该实验室保存。

1.1.3 主要试剂及仪器

试剂：Trans-T1感受态细胞、2xEasyTaqPCR Super Mix(全式金)；琼脂糖(西班牙)；LB broth(MDBio，Inc)；卡那霉素(Kana)、四环素(Tet)、氨苄青霉素(Amp)、IPTG粉末；苯酚∶氯仿混合液(25∶24)等(Solarbio)；质粒小抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA);HiScribeTMT7High Yield RNA Synthesis Kit(NEB)；限制性内切酶EcoRI、NotI、Hinglll、XhoI(Thermo)；ClonExpressII One Step Cloning Kit、RNA-easy提取液(Vazyme)；Trizol Reagent(ambion)；焦炭酸二乙酯(DEPC，biosharp)；异丙醇、无水乙醇均为分析纯；Dnase-/Rnase-free离心管、移液器枪头(Biologix)。

仪器：离心机(湘立TGL16M)；PCR仪(ICycling 96梯度)；摇床(TASITEDY-200B)；电热恒温干燥箱(TASITE202-1AB)；水浴锅(BATHS)；核酸电泳系统(北京六一 DYY-6D)；凝胶成像系统(Wealtec Dolphin1D)；B-500 BIOPHOTO METER(METASH)；-80℃冰箱(Thermo ULTS1368)；超净工作台(江苏通净 VD-650)；超纯水机(青岛富勒姆 FBZ0502-SUP)。

1.2 方法

1.2.1dsgfp基因、引物合成

以来自于720 bpgfp的序列为模板，对其基因进行设计优化，随意改变碱基CG含量，交由南京金斯瑞生物科技有限公司完成基因合成。人工合成了5组不同长度组合的dsgfp片段：201 bp长度的30%CG 含量的dsgfp(简称201-30CG，下同)、201-50CG、423-30CG、423-50CG、423-70CG。以T7启动子为起始序列设计、合成引物，用于体外合成dsgfp。以XhoI、HindIII(L4440)和KpnI、NotI(pET-2p)为双酶切位点设计、合成引物，用于构建L4440-gfp和pET-2p-gfp表达载体。表1，图1

图1 不同长度、CG组合的dsgfp片段序列Fig.1 Sequence of dsgfp fragments of different lengths and CG combinations

1.2.2 重组表达载体构建

1.2.2.1 感受态细胞制备

HT115(DE3)二代甘油超低温保存菌种以1∶1 000接种于含四环素(Tet+)液体LB培养基中，37℃ 250 g离心力培养过夜。挑取单克隆37℃ 250 g离心力培养5 h。活化后菌液1∶100在LB液体培养基(Tet+)37℃ 250 g离心力培养2～3 h，至OD为0.4～0.6。将菌液冰上放置10 min，使温度降至0℃，0.1 mol/L CaCl2溶液同时放置冰上预冷。4℃ 4 000 g离心力10 min。沉淀中加入5∶1体积预冷后0.1 mol/L CaCl2溶液悬浮。冰上放置15～30 min，4℃ 4 000 g离心力10 min。沉淀加入25∶1体积0.1 mol/L CaCl2溶液和25∶1体积30%甘油，冰上放置10 min。菌体重悬，分装并-80℃保存。

1.2.2.2 目的基因PCR扩增及回收

以人工合成的目的片段为模板，使用表1引物进行L4440-gfp、pET-2p-gfp目的片段PCR反应：94℃ 3 min；94℃ 30s、61℃ 30s，每个循环降0.5℃、72℃ 30s，10个循环；94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 30s，35个循环；72℃10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带运用试剂盒回收。

1.2.2.3 L4440-gfp与pET-2P-gfp表达载体的构建(1) L4440载体与pET-2p载体线性化

L4440载体双酶切体系为：6 μL DNA、2 μL XhoI、2 μL HindIII、2 μL 10xFastDigest Green Buffer、8 μL dd H2O，总体积为20 μL，37℃ 15 min；80℃ 10 min。pET-2p载体双酶切的体系为：6 μL DNA、2 μLNotI、2 μLKpnI、2 μL 10xFastDigest Green Buffer、8 μL dd H2O，总体积为20 μL，37℃15 min；80℃ 5 min。1%琼脂糖凝胶电泳，回收目的DNA。

(2) L4440-gfp与pET-2p-gfp重组载体构建与表达

使用ClonExpressII One Step Cloning Kit将线性化质粒与目的片段重组，反应体系为：10 μL重组产物加入100 μL Trans-T1感受态，涂布至固体LB培养基(L4440:氨苄青霉素Amp+、pET-2p:卡那霉素KaNa+)37℃倒置过夜。次日挑取单克隆37℃ 250 g离心力培养5 h。运用表1的引物进行菌液PCR验证。验证正确的菌液1∶100接种于LB液体培养基中(L4440:Amp+、pET-2p:KaNa+)37℃ 250 g离心力培养3.5 h，提取质粒进行双酶切验证，剩余菌液送北京华大基因公司测序。

将验证正确的质粒转入HT115(DE3)感受态，涂布至LB固体培养基上(L4440:Amp+、pET-2p:KaNa+)37℃倒置过夜。次日挑取单克隆37℃ 250 g离心力培养5 h。运用表1引物进行菌液PCR验证，保存验证成功的菌液。

1.2.3 dsgfp的诱导表达

将验证正确的菌液1∶1 000接种于LB液体培养基(L4440:Amp+、Tet；pET-2p:KaNa+、Tet+)37℃ 250 g离心力活化过夜。以1∶100接种于LB液体培养基(L4440:Amp+、Tet+；pET-2p:KaNa+、Tet+)37℃ 250 g离心力培养3.5 h，加入IPTG溶液继续振荡培养5 h。取1 mL菌液提取总核酸，1%琼脂糖电泳检测，Image J软件灰度分析电泳条带。将成功诱导dsgfp的菌液加50%甘油(1∶1)-80℃保存。

1.2.4 体外合成dsgfp

1.2.4.1 DNA模板制备

将成功诱导dsgfp的菌液1∶1 000接种于LB液体培养基(L4440:Amp+、Tet+；pET-2p:KaNa+、Tet+)37℃ 250 g离心力培养12～16 h提取质粒。运用含有T7启动子目的引物进行PCR反应，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切下目的条带运用试剂盒回收。表1

1.2.4.2 体外转录、退火形成dsgfp

反应体系为：NTP Buffer Mix 10μL，Template DNA 8 μL(0.5 μg)，T7 RNA polymerase Mix 2 μL，总体积为20 μL。37℃温浴4～6 h。将反应液于70℃水浴10 min，冷却至室温。加入10∶1体积Dnase I和Rnase A稀释液(稀释200倍)，37℃ 30 min。取1 μL合成dsgfp溶于10 μL Nuclease-Free water，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，产物-80℃保存。

1.2.5 4种方法分别提取l4440-gfp和pET-2p-gfp表达dsgfp

1.2.5.1 Trizol法

取50 mL诱导菌液，4℃ 7 500 g离心5 min。沉淀加入50∶1体积 Trizol，震荡，室温放置5 min。加入5∶1体积氯仿，震荡15s，室温放置10 min，4℃ 12 000 g离心15 min。上清加入2∶1体积异丙醇，颠倒5～6次，室温静置10 min，4℃ 12 000 g离心力10 min。沉淀加入1∶1体积75%乙醇4℃ 7 500 g离心力5 min。重复洗涤1次。沉淀室温静置5～10 min后加入30 μL DEPC水。溶解的dsRNA加入10∶1体积稀释的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.5.2 酚氯仿法

取50 mL诱导菌液，4℃ 7 500 g离心力5 min。沉淀加入100∶1 体积STE buffer，涡旋振荡。加入1∶1体积苯酚：氯仿混合液(25∶24)，涡旋100s。4℃ 15 000 g离心力15 min，上清加入2∶1体积异丙醇，室温静置10 min，4℃ 12 000 g离心力10 min。沉淀加入1∶1体积 75%乙醇4℃ 7 500 g离心力5 min。重复洗涤1次。沉淀室温静置5～10 min后加入30 μL DEPC水。溶解的dsRNA加入10∶1体积稀释的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.5.3 RNA-easy提取液

取50 mL诱导的菌液，4℃ 7 500 g离心力5 min，1xPBS清洗沉淀。加入100∶1体积 RNA-easy提取液，室温12 000 g离心力15 min。上清加入1∶1体积异丙醇，室温静置10 min。室温12 000 g离心力10 min。沉淀加入1∶1体积 75%乙醇4℃ 7 500 g离心力5 min。重复洗涤1次。沉淀室温静置5～10 min后加入30 μL DEPC水。溶解的dsRNA加入10∶1体积稀释的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.5.4 75%酒精沉淀法

取50 mL诱导菌液，4℃ 7 500 g离心力5 min，沉淀加入25∶1体积 75%乙醇，室温静置5 min。加入4∶1体积150 mmol/L NaCl溶液，室温静置60 min，4℃ 12 000 g离心力10 min。上清加入10∶1体积稀释的Rnase A和Dnase I消化后，37℃ 15 min，-80℃保存。

1.2.6 dsgfp浓度、纯度测定

1.2.6.1 体外合成dsgfp浓度、纯度

取2 μL dsgfp样品于B-500 BIOPHOTO METER检测，用Nuclease-Free water分别稀释至浓度为1 000、500、250、125、62.5和31.25 ng/μL并检测A260/A280、A260/A230。稀释dsgfp 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测120 V 25 min。

1.2.6.2 菌液提取dsgfp浓度、纯度

取2 μL dsgfp样本于B-500 BIOPHOTO METER检测，用Nuclease-Free water分别稀释至浓度为1 000、500、250、125、62.5和31.25 ng/μL并检测A260/A280、A260/A230。稀释dsgfp 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测120 V 25 min。

1.2.7 损失率检测及dsgfp产量

将体外合成的5组dsgfp分别稀释至1 000 ng/μL，将30 μL稀释液混合至50 mL未经IPTG诱导菌液中，运用以上4种方法进行提取，B-500 BIOPHOTO METER检测浓度、A260/A280和A260/A280。运用最佳提取方法分别提取1 mL菌液dsgfp测定浓度，根据提取方法损失率，计算pET-2P、L4440表达的dsgfp产量。

1.3 数据处理

运用Image J软件分析载体表达dsgfp灰度值。Microsoft office Excel 2010、SPSS 25.0软件对体外合成dsgfp以及菌液提取dsgfpA260/A280、A260/A230值进行多重方差分析和新复极差法进行显著性分析。2样本间均数比较采用配对T检验。

2 结果与分析

2.1 IPTG诱导基于PET-2P、L4440产生dsgfp

pET-2p和L4440经IPTG诱导表达产生dsRNA，经RNase A消化后1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，pET-2p-gfp和L4440-gfp表达载体。图2

2.2 pET-2P、L4440产生dsgfp电泳条带

研究表明，基于pET-2P载体表达的5组不同长度、不同CG含量的dsgfp灰度值均高于基于L4440载体表达的5组不同长度、不同CG含量的dsgfp灰度值，具有显著差异(P<0.05)。其中pET-2p表达201-30CG以及423-30CG灰度值明显高于L4440表达201-30CG和423-30CG灰度值。图3

注：a：基于pET-2p表达dsgfp；b：基于L4440表达dsgfp。D2000:分子质量标记(天根)，其大小分别是2 000、1 000、750、500、250、100；DL5000：分子质量标记(TaKaRa)，其大小分别是5 000、3 000、2 000、1 000、750、500、250、100Note:a:express dsgfp based on pET-2p,b:express dsgfp based on L4440.D2000：molecular mass marker(Tiangen)of 2,000,1,000,750,500,250,100;DL5000：molecular mass marker(TaKaRa)of 5,000,3,000,2,000,1,000,750,500,250,100图2 基于pET-2p和L4440表达dsgfp 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测Fig.2 Agarose gel electrophoresis detection based dsgfp 1.5% pET-2p and L4440 expression

2.3 体外合成dsgfp浓度、纯度

研究表明，分别梯度稀释6组浓度，每组dsgfp A260/A280均在1.9～2.2，合成的5组dsgfp纯度较高。稀释至31.25 ng/μL的5组dsgfp稀释液，A260/A230值均在3.2～5.0，浓度过低，达到仪器检测最小阈值，出现偏差。其余5组dsgfp稀释液均在2.2～3.0。5组体外合成dsgfp可以作为标准品，进行后续实验。图4，图5

注：D2000:分子质量标记(天根)，其大小分别是2 000、1 000、750、500、250、100Note:D2000：molecular mass marker(Tiangen)of 2,000,1,000,750,500,250,100图4 体外合成dsgfp 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测Fig.4 Detection dsgfp 1.5% agarose gel electrophoresis

注：a：5组dsgfp稀释至不同浓度检测A260/A280；b：5组dsgfp稀释至不同浓度检测A260/A230Note:a：five groups dsgfp diluted to different concentrations A260/A280 detection;b：five groups dsgfp diluted to different concentrations A260/A230 detection图5 体外合成5组dsgfp浓度、纯度Fig.5 Analysis of dsgfp concentration and purity of five groups synthesized in vitro

2.4 4种方法提取菌液dsRNA

2.4.1 提取基于pET-2p载体表达dsgfp

研究表明，根据提取dsgfp核酸检测值，对A260/A280和A260/A230利用SPSS分别构建多重比较模型，模型截距(F=19 202.406,P=0.000)(F=922.24，P=0.000)，提取方法因素(F=28.408，P=0.000)(F=21.833，P=0.000)分别达极显著水平，浓度因素分别达到显著水平(F=2.868，P=0.041)和不显著水平(F=0.297，P=0.909)。新复极差法显著性检验显示不同浓度之间差异不显著。提取纯度最高的Trizol法和酚氯仿法(CK为对照)，且这两者差异不显著，其次是75%酒精沉淀法，提取纯度最低的为RNA-easy提取液。图6，图7

2.4.2 提取基于L4440载体表达dsgfp

研究表明，根据提取dsgfp核酸检测值，对A260/A280和A260/A230利用SPSS分别构建多重比较模型，模型截距(F=15 242.017，P=0.000)(F=734.211，P=0.000)，提取方法因素(F=30.300，P=0.000)(F=24.085，P=0.000)分别达极显著水平，浓度因素分别达到显著水平(F=3.453，P=0.021)和不显著水平(F=0.344，P=0.880)。新复极差法显著性检验显示不同浓度之间差异不显著。提取纯度最高的Trizol法和酚氯仿法(CK为对照)，且这两者差异不显著，其次是75%酒精沉淀法，提取纯度最低的为RNA-easy提取液。图6，图7

注:数据后附不同字母者表示在0.05水平上差异显著(邓肯氏新复极差法)；CK：体外合成；Tri：Trizol法；Phe：酚氯仿法；Alc：75%酒精沉淀法；RIR：RNA-easy提取液；a：提取pET-2p和L4440表达dsgfp，分别稀释至不同浓度检测A260/A280；b：提取pET-2p和L4440表达dsgfp，分别稀释至不同浓度检测A260/A230Note:Those with different letters after the data indicate significant differences at the 0.05 level(Duncan's new multiple range method);CK:in vitro synthesis;Tri:Trizol method;Phe:phenol chloroform method;Alc:75% alcohol precipitation method;RIR:RNA-easy extract;a:Extract pET-2p and L4440 to express dsgfp and dilute to different concentrations to detect A260/A280;b:Extract pET-2p and L4440 to express dsgfp and dilute to different concentrations to detect A260/A230图6 4种方法提取pET-2p和L4440载体表达dsgfp纯度Fig.6 Purity analysis of pET-2p and L4440 vector expression extracted by four methods

注：D2000:分子质量标记(天根)，其大小分别是2 000、1 000、750、500、250、100；a:酚氯仿法提取基于pET2p表达dsgfp(经Dnase I和Rnase A消化，稀释至500 ng/μL)；b：酚氯仿法提取基于L4440表达dsgfp(经Dnase I和Rnase A消化，稀释至500 ng/μL)；c：Trizol法提取基于pET2p表达dsgfp(经Dnase I和Rnase A消化，稀释至500 ng/μL)；d：Trizol法提取基于L4440表达dsgfp(经Dnase I和Rnase A消化，稀释至500 ng/μL)Note:D2000:Molecular mass marker(Tiangen),its size is 2,000,1,000,750,500,250,100;a:Phenol-chloroform extraction method based on pET2p expression dsgfp(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL);b:Phenol-chloroform extraction method based on L4440 to express dsgfp(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL);c:Trizol method extracts dsgfp based on pET2p(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL);d:Trizol method extracts dsgfp based on L4440(digested with Dnase I and Rnase A,diluted to 500 ng/μL)图7 酚氯仿法和Trizol法提取50 mL菌液表达dsgfp 1.5%琼脂糖凝胶电泳Fig.7 Phenol chloroform method and Trizol method to extract 50 mL bacterial solution to express dsgfp 1.5% agarose gel electrophoresis

2.5 4种提取方法损失率

研究表明，4种方法提取后的体外合成dsgfp与提取前的体外合成dsgfp浓度纯度存在明显差异，经SPSS软件分析，差异有统计学意义(P<0.05)。其中酚氯仿法和Trizol法提取的dsgfp浓度、纯度最高，与体外合成的差异最小，计算提取损失率分别为21.44%、23.83%，75%酒精沉淀法和RNA-easy提取液提取的dsgfp浓度、纯度最低，与体外合成差异最大，计算提取损失率分别为32.3%、37.62%。表2

表2 4种方法提取内标混合纯dsgfp浓度、纯度Table 2 Comparison and analysis of the concentration and purity of the internal standard mixed pure dsgfp extracted by four methods

2.6 基于pET-2P、L4440产生dsgfp产量

研究表明，基于pET-2P载体表达5组不同长度、不同CG含量的dsgfp浓度均高于基于L4440载体表达5组不同长度、不同CG含量的dsgfp浓度，具有显著差异(P<0.05)。基于pET-2P和L4440表达载体1 mL诱导菌液可发酵产生8.7～24.39 μg、7.48～22.47 μg dsgfp。图8

注：*表示在0.05水平上差异显著(配对T检验)；a:酚氯仿法提取基于pET-2p和L4440表达dsgfp浓度；b：基于pET-2p和L4440表达dsgfp产量Note:* means significant difference at the 0.05 level(paired T test);a：Phenol chloroform extraction method based on pET-2p and L4440 express dsgfp concentration；b：Based on pET-2p and L4440express dsgfp yield图8 酚氯仿法提取1 mL菌液dsgfp浓度及产量Fig.8 Analysis of the concentration and yield of dsgfp extracted from 1 mL bacterial solution by phenol-chloroform method

3 讨论

邹晓蕾、Eber以及Tyagi等[14-17]均报道了提取细菌总RNA的方法，主要包括Trizol法，酚氯仿法以及部分市售RNA快速提取试剂盒。其中Trizol法在细菌总RNA提取中使用较为普遍，利用异硫氰酸胍等物质迅速裂解细胞，同时抑制核酸酶的活性，保持RNA的完整性，氯仿使RNA溶于水相，从而与蛋白等物质相分离，为提取细菌总RNA的首选方法[18]。苯酚-氯仿抽提也是提取细菌总RNA常用方法之一，利用酚反复抽提使蛋白质变性，SDS(十二浣基磺酸钠)使细胞裂解，加入氯仿分层，获得含总RNA的水相[19]。市售总RNA提取试剂盒成本较高、使用次数有限，不适用于大量提取检测，故未选用进行实验。研究表明，以体外合成dsgfp为对照CK，通过使用Trizol法和酚氯仿法可高效提取细菌完整总RNA，经Rnase A与Dnase I消化后，可得到较为纯净的dsgfp，损失率最低。RNA-easy提取液和75%酒精沉淀法提取效率明显低于前者，不适用于快速提取细菌总RNA以及dsgfp。与前人的研究结果基本一致。运用酚氯仿法，分别取1 mL诱导菌液提取pET-2p和L4440表达的dsgfp，检测核酸浓度，发现2个载体表达的423-30CG明显高于其他4组，说明pET-2p和L4440均具有较强的表达能力。通过浓度分析，根据提取损失率计算1 mL菌液dsgfp产量，发现基于pET-2p产生的5组dsgfp产量均高于L4440产生的5组dsgfp产量，最高可达24.39 μg/mL，pET-2p可作为dsgfp的相对最优表达载体，用于后续研究。

提取、纯化原核表达dsRNA对于真核生物来说，难度更大，尚无成熟方法借鉴[20]，研究采用4种常用提取细菌总RNA的方法，试图通过提取完整纯净的总RNA，经Rnase A、Dnase I消化得到纯净的dsRNA。Trizol法和酚氯仿提取细菌总RNA，经Rnase A、Dnase I消化后，稀释核酸检测A260/A280、A260/A230，均值分别为1.77、1.83和1.74、2.1，与体外合成dsRNA值差异最小。但1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，稀释至不同浓度的dsgfp条带均出现不同程度弥散，无法得到清晰电泳图，可能存在以下原因：原核诱导表达的dsgfp脆弱，使用有机溶剂以及提取过程中反复高速离心损伤dsgfp；核酸检测稀释时间过长，dsgfp在自然环境下发生降解；电泳液含有核酸酶。