基于网络药理学探讨逍遥丸对心理应激性不孕免疫调节的可行性和潜在作用机制

张 冬，段彦苍，陈景伟，贺 明，范丽洁，李 慧，孟 鑫，李 颖，杜惠兰

有资料显示，不孕症已成为仅次于肿瘤、心血管疾病的第3大疾病[1]。美国生殖医学学会和美国生殖内分泌协会发表的一项规范指出，心理应激是生育及性功能障碍的重要因素[2]。女性焦虑水平可以影响其自然受孕率，焦虑水平高的不孕症患者经过放松治疗能够提升其受孕率[3]。研究表明，慢性心理应激条件下的女性机体自身免疫平衡状态更易被破坏[4]。中医药治疗不孕症已取得很好的成效，且中药具有免疫促进和免疫抑制的双向调节作用。疏肝法已成为临床治疗不孕症的主要治法之一，其代表方剂——逍遥丸具有促进卵泡发育及卵母细胞成熟，改善子宫内膜容受性，提高临床受孕率等作用[5],同时在治疗女性相关的焦虑症和抑郁症中效果显著[6]。研究表明，逍遥丸可抑制慢性应激小鼠胸腺细胞凋亡，提高胸腺双阳T细胞数量；降低人外周血Th1/Th2比率和Th17细胞数量，改善亚健康状态[7]。逍遥丸不仅可改善母体受孕环境，缓解女性抑郁状态，还具有潜在的免疫调节作用。网络药理学将网络科学、生物信息学、计算机科学和数学等学科方法结合到中药药理研究中，通过多靶点与疾病关系角度构建药物-药物、药物-靶标等网络，来预测药物的功效以及特定功效对应的药物[8]。因此本研究拟基于网络药理学的研究原理和方法，探讨逍遥丸对心理应激性不孕免疫调节的可行性和潜在作用机制，以期为后续的实验研究和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1药材成分靶点 利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)对逍遥丸中八味药材：柴胡、薄荷、当归、白芍、茯苓、白术、生姜、甘草分别进行化学成分搜集。根据ADME参数设置口服生物利用度(OB)≥30%及类药性指数(DL)≥0.18为筛选条件，获得具有较高活性的化合物成分以及对应的靶标蛋白。

1.2疾病靶点收集 分别以“psychological stress infertility”“immunoregulation”为关键词在Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)和Genecards两个数据库检索相关的基因靶点，然后将筛选结果合并，均保留唯一值。

1.3逍遥丸和疾病交集靶基因 使用在线工具Venn对逍遥丸和心理应激性不孕及免疫调节的靶基因绘制维恩图。

1.4蛋白-蛋白互作(PPI)网络构建 将逍遥丸与心理应激性不孕及免疫调节的共同靶点输入STRING中的“multiple proteins”，选择“Homo sapiens”检索。最低相互作用得分设定为 0.7、并隐藏断开连接的节点，得到PPI。下载蛋白相互作用的tsv文件，将其导入Cytoscape，根据节点自由度筛选重要靶点。

1.5功能富集分析 使用R语言cluster Profiler软件包，对共同靶点进行GO和KEGG功能富集分析，以BH方法调整后的P< 0.05(p.adjust < 0.05)为标准筛选显著富集的GO条目和KEGG通路，并以条形图、气泡图和网络图对部分结果进行展示。

2 结果

2.1逍遥丸成分靶点收集结果 通过 TCMSP 数据库共检索收集到1357种成分，其中349种来自于柴胡，164种来自于薄荷，125种来自于当归，85种来自于白芍，34种来自于茯苓，55种来自于白术， 265种来自于生姜，280种来自于甘草。以OB≥30%且DL≥0.18为条件，筛选出161种活性化合物，其中17种来自于柴胡、10种来自于薄荷、2 种来自于当归、13 种来自于白芍、15 种来自于茯苓、7 种来自于白术、5 种来自于生姜、92 种来自于甘草。逍遥丸八味药材通过Uni prot数据库获得基因名称的靶点249个。逍遥丸部分潜在活性成分信息见表1。

表1 逍遥丸部分潜在活性成分信息

2.2逍遥丸与心理应激性不孕靶点的筛选结果 OMIM 数据库中筛选到心理应激性不孕靶点194个、免疫调节靶点6个。Genecards 数据库中找到心理应激性不孕靶点973个，找到关于免疫调节靶点569个。将两个数据库筛选到的靶点去除重复后心理应激性不孕相关靶点有1133个，免疫调节相关靶点有570个。将心理应激性不孕、免疫调节和逍遥丸的靶点基因绘制维恩图，结果显示心理应激性不孕和免疫调节交集靶基因226个，心理应激性不孕、免疫调节和逍遥丸三者交集靶基因53个。

2.3PPI网络分析结果 将筛选的逍遥丸-心理应激性不孕-免疫调节共有的53个靶点上传至STRING数据库，组织(Organism)设置为“Homo sapiens”，以得到PPI。见图1。此网络中共包含50个节点，384条边，连接节点边的数目越多，成为核心基因的可能越大。去掉断开连接的节点，网络图中共有节点50个。图中不同颜色的线代表不同的相互作用类型。下载tsv文件将其导入Cytoscape，作出“逍遥丸-靶标-心理应激性不孕-免疫调节”网络图。见图2。图中橙色菱形代表逍遥丸，紫色倒三角代表心理应激性不孕，粉色正三角代表免疫调节。圆形节点代表基因，圆形越大、颜色越深表示自由度越大，该基因在网络中越重要。节度值自由度前20的靶点蛋白包括白细胞介素6(IL6)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素1β(IL1β)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、血管内皮生长因子(VEGFA)、CC类趋化性细胞因子2(CCL2)、CXC类趋化性细胞因子8(CXCL8)、细胞间黏附因子1(ICAM1)、白细胞介素10(IL10)、肿瘤蛋白TP53(TP53)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、信号转导与转录激活因子1(STAT1)、白细胞介素2(IL2)、表皮生长因子(EGF)、白细胞介素4(IL4)、重组人血红素氧合酶-1(HMOX1)、重组蛋白(IFNG)，这可能是逍遥丸治疗心理应激性不孕免疫调节中发挥作用的关键潜在靶点。

图1 逍遥丸-心理应激性不孕-免疫调节靶蛋白相互作用

图2 逍遥丸-靶标-心理应激性不孕-免疫调节网络图

2.4GO功能富集分析 为进一步明确所筛选靶点的作用机制，本课题组通过R语言cluster Profiler 包对逍遥丸、心理应激性不孕及免疫调节的53个交集靶基因进行GO功能富集分析，共富集到1868条生物过程(BP)条目，29条细胞成分(CC)条目，70条分子功能(MF)条目。对最显著富集的前15条BP、CC、MF条目应用气泡图进行展示，见图3。图中横轴为基因富集比例，纵轴为富集到的GO条目，气泡大小代表富集到的基因数目的多少，气泡的颜色代表调整后的P值。根据报告显示，前述所筛选靶点，BP主要参与炎症反应、T细胞激活、氧化应激反应等过程，CC主要涉及细胞膜、染色质、核染色质转录因子复合物等区域，MF主要包括炎性因子受体结合、炎性因子活性、蛋白酶结合、抑制转录因子结合、TNF结合等方面。

图3 逍遥丸、心理应激不孕及免疫调节53个交集靶基因GO功能富集分析A.生物过程条目； B.细胞成分条目； C.分子功能条目

2.5KEGG功能富集分析 通过R语言cluster Profiler 包对逍遥丸、心理应激性不孕及免疫调节的53个交集靶基因进行KEGG功能富集分析共富集到154条KEGG通路，对最显著富集的前15条结果应用柱状图展示，见图4A。横轴为富集到的基因数目，柱状的长短代表富集到的基因数目的多少，条形颜色代表调整后的P值。对最显著富集的前5条KEGG通路做靶点和通路的相互作用网络图，见图4B。对最显著富集的前15条KEGG通路做通路之间的调控网络图，见图4C。图中黄色的点代表通路，灰色的点代表靶点基因，此处基因用Uniport符号表示。其中信号通路主要集中在与糖尿病并发症相关的AGE/RAGE、IL17、TNF和癌症信号通路等。

图4 逍遥丸、心理应激性不孕及免疫调节53个交集靶基因KEGG功能富集分析A.KEGG通路富集柱状图(前15)；B.KEGG通路靶点和通路相互作用网络图(前5)；C. KEGG通路间调控网络图(前15条)

3 讨论

应激状态时遵照生存优先的原则，机体的应激反应与生长发育和繁殖相关[9]。心理状态是独立于年龄、不孕时间等因素以外的，影响自然妊娠率及治疗效果的重要因素[10]。激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴是应激时最主要的神经内分泌改变。在慢性应激条件下由于糖皮质激素的持续增高表现为免疫功能的抑制，女性自身免疫平衡状态较男性更易破坏，可表现为向Th1/Th17促炎状态的转变[4]。大量临床数据显示，不孕症患者外周血或复发性流产患者子宫内膜中Th1和Th17细胞比例显著增加，Th1和Th17 型细胞因子亦相应增加[11]。通过调节对HPA轴作用可提高心理应激性不孕症患者妊娠率[12]。正常妊娠时母体细胞免疫功能受到抑制，免疫反应以体液免疫为主，发生由Th1/Th17向Th2/Treg型反应漂移现象[13]，在IL17、IL6、TNF-α、IL1β等大量细胞因子的参与下，通过MAPK/STAT3/NF-κB等信号转导通路，完成妊娠免疫耐受和免疫应答等过程[14]。逍遥丸调节作用广泛，涉及机体神经内分泌、免疫等系统。因此本研究基于网络药理学平台，应用相关数据库及软件，构建“逍遥丸-心理应激性不孕-免疫调节”的关键靶点和信号通路网络，以探讨逍遥丸对心理应激性不孕潜在的免疫调节作用及可能的机制。

本研究筛选出161种活性化合物，主要为黄芩苷、豆甾醇、β-谷甾醇、槲皮素、毛地黄黄酮、芍药苷、圣草酚等。筛选出逍遥丸-心理应激性不孕-免疫调节相关靶点，如IL6、STAT3、TNF、IL1β、MAPK1、VEGFA、MMP9等，主要涉及炎症反应、T细胞激活、氧化应激反应以及细胞膜、染色质、核染色质转录因子复合物等区域，与IL17、TNF等信号通路有关。文献报道，黄芩苷可改善脂多糖诱导孕鼠的子痫前期症状，降低大鼠胎盘中促炎细胞因子的水平，具有强效抗抑郁作用[15-16]。豆甾醇和β-谷甾醇可显著降低结肠组织IL1β、IL6水平[17]。槲皮素可降低创伤性脑损伤后IL6、TNF-α水平，改善神经功能缺损和认知功能[18]，同时对大鼠卵巢卵泡发育和成熟有一定的促进作用[19]。芍药苷可通过MAPK/NF-κB 等通路，影响IL17等细胞因子的生成，发挥抗炎和免疫调节作用[20]。圣草酚具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及神经系统保护等多种药理活性[21]。在KEGG所筛选的较为集中的信号通路中，IL17的促炎特性是其宿主保护能力的关键，对宿主防御、组织修复、炎症疾病的发生起重要作用，MAPK/NF-κB-TNF-α是与IL17密切相关的信号通路，生物学上，维持IL17信号的致病和保护作用的平衡是非常必要的[22-23]。 TNF-α是健康有机体和疾病条件下哺乳动物免疫反应的关键中介和调节因子，诱导NF-κB和MAP活性是其主要的生化功能，在诱导T细胞亚群的激活、分化和存活中发挥重要作用[24]。

综上所述，逍遥丸有效成分黄芩苷、豆甾醇等在抗炎、免疫调节和神经系统保护方面发挥重要作用，涉及IL6、TNF等蛋白以及机体免疫调节关键的IL17信号通路和TNF信号通路等，具有多成分、多靶点和多途径且相互调节的特点，为临床应用逍遥丸对心理应激性不孕免疫调节的可行性和潜在作用机制提供了理论依据，后续将以此依据进行相关的实验验证。