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儿童急性横贯性脊髓炎的潜在治疗靶点实验研究

2021-11-01王志杰王天仪

解放军医药杂志 2021年10期
关键词:背根神经节靶点

师 洋,王志杰,王天仪

目前,急性横贯性脊髓炎(acute transverse myelitis, ATM)临床仍然缺乏行之有效的治疗方法。儿童时期是ATM患者发病率较高的阶段之一[1]。ATM患者存在暂时或永久性运动、感觉和自主神经功能障碍,约33%的患者遗留严重感觉功能异常[2]。基质金属蛋白酶(MMP)在基底膜降解过程中起作用,可以引起血脑屏障破坏,并在炎症过程中发挥重要作用。有研究报道中枢神经系统损伤后神经元自身表达的MMP-9上调[3-4]。Cardone等[5]研究发现MMP-9的过表达可直接影响神经元生长状态。Gu等[6]报道,在体外培养神经元中加入活化的MMP-9可改变其生长状态,而加入MMP-9抑制剂后可减少神经元凋亡。Asahi等[7]报道MMP-9能够特异性地降解髓鞘碱性蛋白(MBP),以致广泛的脱髓鞘和生长锥崩解进而导致中枢神经传导功能损伤。MicroRNA(miRNA)是可以在转录后水平调控基因表达的非编码RNA,其与生物体的遗传性状、生长发育和疾病的发生发展有密切的关系[8]。miRNA组学(miRNomes)能够同时观察在某个生命现象中全部已知关键miRNA发生的变化及其对靶基因组的动态表达调控过程[9]。本研究旨在运用miRNomes的方法以系统的、全局的视角去探寻儿童ATM关键调控机制,并寻找精准、高效的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月—2019年6月在承德医学院附属医院和解放军联勤保障部队第九八一医院诊断为ATM的患儿4例为观察组,临床怀疑相关疾病且经脑脊液等相关检查排除疾病后脑脊液正常的患儿3例为对照组。纳入标准:观察组均符合2002年横贯性脊髓炎联盟工作组织(TMCWG)提出的诊断标准,年龄<14岁。2组患儿监护人签署知情同意书。排除标准:观察组为除ATM外其他疾病者;近期曾患感染性疾病者;有家族遗传病史者;有结核病史者;生长发育迟缓、营养不良者。对照组近期曾患感染性疾病者;有家族遗传病史者;有结核病史者;生长发育迟缓、营养不良者。

1.2样本采集和总RNA提取 2组均取脑脊液,并将观察组脑脊液样本随机编号T1、T2、T3、T4,随后冻存。生物信息分析试验部分将对照组样本进行混样操作。本研究通过我院医学伦理委员会审批,项目编号为201606A062。根据说明书中的操作步骤,使用mirVanaTMPARISTMKit试剂盒(Ambion,美国)提取总RNA。每例样本取2 ml,迅速转入抗凝管中用移液器混匀。在室温下1 h内进行以下步骤:4 ℃条件下820×g离心10 min。取1 ml上清液放入无菌的1.5 ml离心管中离心,4 ℃,16 000×g,共10 min。将上清液移至干净的离心管中,并保存在-80 ℃下备用。取400 μl样本加入等量的2×Denaturing Solution涡旋混匀,放置于冰上,5 min后加入相同体积的氯仿,涡旋混匀(30~60 s)后室温下离心,最高转速,共5 min。取上清加入1.25倍体积的无水乙醇涡旋混匀。将其移至最大体积为700 μl的纯化柱中离心,13 000×g,共30 s。向离心柱中加入350 μl 的miRNA Wash Solution 1,室温下离心,13 000×g,共15 s,弃流过液,将离心柱放回收集管中。将10 μl DNase Ⅰ和 70 μl Buffer RDD QIAGEN混合,加入离心柱中的膜上于室温放置,共15 min。向离心柱中加入350 μl miRNA Wash Solution 1,室温下离心,13 000×g,共15 s,弃流过液,将离心柱重新放入收集管中。500 μl的 Wash Solution 2/3清洗纯化柱2次,空柱离心1 min。将离心柱放在新的收集管中,加入100 μl 在95 ℃条件下预热的Elution Solution,室温下离心,最高转速,共20~30 s,收集管中的液体即所提取的总RNA,在-70 ℃冰箱保存。

1.3miRNA表达谱数据分析 采用miRNA 4.0芯片(Affymetrix,美国)分析发生改变的miRNA。总RNA定量及完整性分别利用NanoDrop ND-2100(Thermo Scientific,美国)和Agilent 2100(Agilent,美国)检测。确定样品可用后依据芯片标准方案,对样本标记、芯片杂交和洗脱。原始图像用Affymetrix Scanner 3000(Affymetrix,美国)扫描获得,应用Expression Console version1.3.1(Affymetrix,美国)数据分析软件分析。将原始数据进行RMA标准化算法处理,获得标准化后的表达谱数据。利用分层聚类分析法对样本间差异表达的miRNA进行分析。

1.4miRNA的表达量检测 应用miScript Ⅱ Reverse Transcription Kit (Qiagen,德国),采用RT-qPCR检测miRNA的表达量,以U6作为miRNA表达的内参。应用PrimerScript RT reagent Kit (TaKaRa,日本)检测miRNA的表达量,以GADPH作为miRNA表达的内参。

1.5MMP-9蛋白水平检测 酶联免疫吸附试验(ELISA)严格按照说明书操作步骤,使用美国R&D System公司生产的试剂盒检测MMP-9基因蛋白水平。Western blot检测细胞中MMP-9表达水平:将各样本置入RIPA裂解液,加入蛋白酶抑制剂后离心分离。分离蛋白样品转至硝酸纤维素膜。封膜后加入抗体,而后用ECL发光试剂检测。

1.6细胞培养及转染 在无菌条件下,取出新生Wistar大鼠背根神经节(DRG)放入D/F12+10%胎牛血清培养基中,放入24孔板,待神经元贴壁后更换为Neurobasal+B27培养基,培养3 d后进行实验。实验分为空白组、扩增乱序组、抑制乱序组、miR-133过表达组、miR-133抑制组。将miR-133b模拟物(miR-133b mimics)与抑制物(miR-133b inhibitor,GenePharma,中国)参照说明书流程进行转染(YIJUN,中国)。

2 结果

2.1儿童ATM MicroRNA表达谱分析 与对照组比较,观察组样本中发生表达变化的miRNA共有681个。见图1A。与对照组比较,T1~T4 miR-133b在各样本中明显下调,信号值分别为1.41、2.71、2.63、2.68。根据同一聚类miRNA可能具有相似生物学功能的理论[8],本实验聚类分析结果显示T1~T4样本中miR-133b表达变化被聚为一类,执行与健康对照样本不同的生物学功能。见图1B。因此本研究的治疗靶点为miR-133b。RT-qPCR验证miR-133b表达和基因芯片结果一致。见图1C。

图1 各组脑脊液样本中microRNA表达谱分析A.横列为microRNA的表达差异(纵列为不同样本,蓝色为下调,黄色为上调,上方颜色标尺为其余颜色所代表的变化);B.miR-133b在各样本中表达的聚类分析(蓝色为下调,红色为上调,上方颜色标尺为其余颜色所代表的变化);C.RT-qPCR检测的各样本miR-133b相对表达量

2.2miR-133b靶基因预测 应用Target Scan数据库以及查阅相关文献预测出MMP-9为miR-133b的靶基因[10],进而探究miR-133b表达变化的意义。MMP-9 3' UTR的第43~49位点:5' ...UGUAAAUCCCCACUGGGACCAAC..., hsa-miR-133b:3' AUCGACCAACUUCCCCUGGUUU。

2.3MMP-9蛋白表达 对照组MMP-9为237.24 μg/L,观察组T1~T4分别为663.15、389.00、420.71、409.91 μg/L。与对照组比较,观察组脑脊液样本中MMP-9蛋白表达明显上调(P<0.05),其表达趋势与miR-133b相反。见图2。

图2 观察组T1~T4与对照组MMP-9蛋白与miR-133b表达水平比较MMP-9为基质金属蛋白酶-9

2.4miR-133b通过MMP-9影响背根神经节神经元轴突生长 与空白组比较,miR-133b过表达组背根神经节神经元生长状态相对较好,轴突明显延长(P<0.05)。miR-133b抑制组背根神经节神经元轴突生长明显弱于空白组(P<0.05)。见图3A、3B。与空白组比较,miR-133b过表达组中MMP-9蛋白表达明显下调,miR-133b抑制组中MMP-9蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图3C。

图3 5组背根神经节神经元中miR-133b与MMP-9蛋白及轴突生长的关系A.背根神经节神经元生长状态(免疫荧光×200),红色为用NF-200标识的背根神经节神经元,蓝色为DAPI;B.背根神经节神经元轴突生长情况;C.MMP-9蛋白表达水平;MMP-9为基质金属蛋白酶-9;与空白组比较,aP<0.05

3 讨论

ATM是横贯性脊髓炎的炎症亚型,在疾病发作后的急性期和亚急性期会出现脊髓损害临床症状,导致神经传导障碍。目前ATM的发病机制仍难以明确[11]。儿童时期是ATM发病率最高的时期之一。本实验应用microarray 4.0芯片检测相较于健康儿童样本而言在ATM样本发生差异表达的microRNA,以期寻找在ATM疾病中发生作用的关键调控机制。miR-133b在ATM样本中明显下调,因此初步将该miRNA纳入研究。

本研究应用Target scan数据库查询,发现miR-133b的靶基因可能为MMP-9。有学者报道MMP-9能够特异性地降解MBP,以致广泛的脱髓鞘和生长锥崩解进而导致神经传导功能损害。本研究结果显示,观察组T1~T4与对照组MMP-9蛋白表达与miR-133b呈相反趋势。这一结果在一定程度证明了MMP-9是miR-133b的靶基因,miR-133b可以造成MMP-9蛋白表达下调,而此时仍然需要细胞层次的功能验证。本研究以DRG神经元为工具细胞,抑制或过表达miR-133b,观察细胞轴突形态以及MMP-9蛋白表达改变,结果显示在神经元水平miR-133b能够通过其靶基因MMP-9调节神经细胞轴突生长状态。

综上所述,ATM患者患病后中枢神经系统miR-133b表达下调,致使其靶基因MMP-9上调产生临床症状。miR-133b是ATM潜在的治疗靶点。ATM后有681个miRNA至少在任一样本发生变化,本研究中miR-133b可能只是ATM潜在的治疗靶点之一,今后的实验中我们将继续探索其他可能发挥作用的关键miRNA及通路,为临床治疗ATM找到更多更有效的治疗靶点和诊断标志物。

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