靶向调节GSK-3β基因对急性一氧化碳中毒大鼠脑损伤的保护作用研究

吴启仙,宁红平,吴兴辉,李厚成

目前，CO中毒发病率和病死率较高[1]。大气中CO的正常浓度<0.001%，当CO浓度为0.1%时可能致命。急性CO中毒会引起严重的神经系统损伤[2]。许多研究表明，免疫和炎症反应在CO中毒后的脑损伤中起重要作用。糖原合成激酶-3β(GSK-3β)在中枢神经系统退行性变中起关键作用。有人提出将GSK-3β失活作为促进神经元存活的机制[3]。药理学抑制剂或RNA干扰诱导的GSK-3β耗竭足以阻止谷氨酸诱导的兴奋性毒性和所产生的神经保护作用。TDZD-8是一种GSK-3β抑制剂，缩小了脑缺血损伤后的梗死体积。最近研究表明，在自身免疫性疾病、帕金森病、出血性脑损伤等疾病中GSK-3β表达上调[4]。信号转导及转录激活因子3(STAT3)是参与诱导炎性介质的关键调节因子。CO中毒所致的脑损伤与脑部的炎症反应密切相关[5]：GSK-3β易位进入细胞核并调节与炎症反应相关的基因转录，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6。因此，减轻炎症反应是急性CO中毒的主要治疗方法之一。本研究探讨靶向调节GSK-3β基因对急性CO中毒大鼠脑损伤的保护作用，为急性CO中毒脑损伤的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，18周龄，体质量310～360 g，由中国北京生命河实验室提供，生产许可证号：SCXK(京)2020-0006，动物使用许可证号：SYXK(京)2020-0012。大鼠圈养在12 h明/暗循环中，温度18～22 ℃，湿度40%～70%，自由进食啮齿类动物饲料和水。将大鼠随机分为正常对照组、CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组，每组20只。

1.2主要药品、试剂与仪器 GSK-3β基因过表达的慢病毒(LV-GSK-3β，批号：qw-2098239.13)、空白慢病毒(LV，批号：982737818.3)均由上海吉凯基因化学技术有限公司提供；ProOx-820动物实验高压氧舱(天津合普)、DS-09水迷宫实验台(上海移数信息科技有限公司)、苏木素-伊红(HE)试剂盒(中国碧云天生物科技，批号：CV-59653.36)、TUNEL法(美国OriGene Technologies生物科技，批号：CB-54893.63)、BX50光学显微镜(日本Olympus Corporation)、Trizol试剂(美国Invitrogen，批号：ED-85463.36)、PrimeScript RT逆转录试剂盒(美国Applied Biosystems公司，批号：CE-4586.36)、ABI 7900系统(美国Applied Biosystems公司)、SYBR Green Master PCR试剂盒(中国碧云天生物科技，批号：SD-45896.36)、总蛋白提取试剂盒(北京Solarbio科学技术有限公司，批号BC3640-50T)；二辛可宁酸测定试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific，批号：2322.635)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，Bio-Rad Laboratories,批号：DE-4789.36)、PVDF膜(美国EMD Millipore，批号：RT-7485.63)、BSA(美国Sigma-Aldrich，批号：RT-741.369)；抗GSK-3β一抗(1∶1000，美国Abcam，目录号ab37150)、抗STAT3一抗(1∶1000，美国Abcam，目录号ab38898)、抗β-actin一抗(1∶1000，美国Abcam，目录号ab8227)、辣根过氧化物酶耦联的山羊抗兔IgG二抗(1∶2000，美国Abcam，批号：ab6721)、ECL化学发光试剂(德国Hanbio Biotechnology Co，批号：CD-48586.36)。

1.3模型制备 CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组大鼠于ProOx-820动物实验高压氧舱吸入CO气体，先暴露于1000 mg/L的CO气体40 min，然后再暴露于3000 mg/L的CO气体20 min；当大鼠碳氧血红蛋白(HbCO)浓度>40%，且意识不清说明CO中毒模型制备成功。建模成功后，慢病毒空白组通过10 μl Hamilton注射器将0.25 μl 的 LV-EGFP 稀释液(4×106TU病毒颗粒)注射到大鼠双侧海马体中；GSK-3β低表达组通过10 μl Hamilton注射器将0.25 μl的LV-GSK-3β稀释液(4×106TU病毒颗粒)注射到大鼠双侧海马体中，1/d，共4 d。CO中毒模型组以同样的方法注射生理盐水。正常对照组无任何处理。

1.4大鼠神经功能评分 CO处理后第6天进行改进的莫里斯水迷宫测试程序。随机选择各组中的6只大鼠进行莫里斯水迷宫测试。使用直径为150 cm的水箱，水温保持在(24±1)℃。水上涂有黑色蛋彩画颜料，以遮盖平台并增加颜色对比度。在象限1的水面下方1 cm处隐藏着一个10 cm×10 cm的黑色平台，将大鼠置于水中的进入点，随机改变为面向象限2、3或4的象限，每次实验持续到大鼠找到固定平台为止，若未找到平台最多持续60 s，同时将平台撤除，开始60 s的探查训练。将大鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花时间(原平台象限停留时间)和进入该象限的次数(经过原平台位置的次数)。将所有大鼠在平台上搁置10 s进行学习，并且每天连续进行4次实验，连续3 d。经过3 d培训后，进行了最终测试。使用莫里斯水迷宫软件系统记录大鼠在每个象限中花费的时间。对于每只大鼠，定位平台平均潜伏时间被视为学习能力的指标。

1.5大鼠脑组织神经细胞凋亡检测 将脑组织在室温下于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，在分级乙醇系列中脱水，然后将其冠状切成4 μm切片。使用二甲苯对切片进行脱石蜡处理，并按降序乙醇系列重新水化。用TUNEL法定量检测神经元凋亡情况。正常细胞核染成蓝色，凋亡阳性细胞核染成棕黄色。在光学显微镜下随机选择5个视野，观察神经元凋亡情况。

1.6大鼠海马组织病理结构观察 海马组织在4%甲醛中固定过夜，石蜡包埋，然后切成4 μm厚的连续切片，进行HE染色以观察CO暴露后海马组织的病理结构变化。

1.7大鼠海马组织GSK-3β、STAT3 mRNA表达水平测定 根据制造商规程，使用Trizol试剂从脑组织中分离总RNA。使用PrimeScript RT逆转录试剂盒将GSK-3β、STAT3逆转录为cDNA。然后在ABI 7900系统上使用SYBR Green Master PCR试剂盒进行qRT-PCR；GSK-3β、STAT3引物由上海生工科技生物合成。PCR热循环条件：在95 ℃初始变性3 min； 40个循环(95 ℃持续20 s和60 ℃持续1 min)。GSK-3β、STAT3表达水平使用2-ΔΔCq方法进行定量检测，并标准化为内部参考基因U6基因。

1.8大鼠海马组织GSK-3β、STAT3蛋白表达水平测定 根据制造商的规程，使用总蛋白提取试剂盒从脑组织中提取总蛋白。使用二辛可宁酸测定试剂盒定量总蛋白，使用10%SDS-PAGE分离蛋白质。电泳后，将蛋白质电转移到PVDF膜上；转移后，将其在含有5%脱脂奶粉的封闭缓冲液中封闭2 h。将膜与抗GSK-3β、STAT3、GAPDH的一抗在4 ℃孵育过夜。然后用Tween-20(TBST)的TBS清洗膜3次，并与辣根过氧化物酶(HRP)耦联的二抗孵育。使用ECL化学发光试剂盒进行检测。使用ImageQuant软件对蛋白印迹进行扫描。

2 结果

2.1大鼠逃避潜伏期、经过原平台位置次数、原平台象限停留时间比较 与正常对照组比较，CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组逃避潜伏期延长，经过原平台位置次数减少，原平台象限停留时间缩短(P<0.05)。与CO中毒模型组、慢病毒空白组比较，GSK-3β低表达组逃避潜伏期缩短，经过原平台位置次数增多、原平台象限停留时间延长(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠逃避潜伏期、经过原平台位置次数、原平台象限停留时间比较

2.2大鼠脑组织神经细胞凋亡水平比较 4组脑组织神经细胞凋亡水平分别为正常对照组(74.59±4.09)个/mm2、CO中毒模型组(827.87±5.76)个/mm2、慢病毒空白组(878.74±4.65)个/mm2、GSK-3β低表达组(453.87±4.75)个/mm2。与正常对照组比较，CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组脑组织神经细胞凋亡水平升高(P<0.05)；与CO中毒模型组、慢病毒空白组比较，GSK-3β低表达组脑组织神经细胞凋亡水平降低(P<0.05)。见图1。

图1 4组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况(TUNEL×400)CO为一氧化碳,GSK-3β为糖原合成激酶-3β

2.3大鼠海马神经元结构病理改变 正常对照组海马神经元结构正常；CO中毒模型组、慢病毒空白组海马神经元排列紊乱，坏死明显，可见炎性细胞浸润，伴白色纤维组织增生；GSK-3β低表达组海马神经元坏死数目减少，炎性细胞浸润减少，白色纤维组织增生面积缩小。见图2。

图2 4组大鼠海马神经元结构病理改变情况(HE×400)CO为一氧化碳,GSK-3β为糖原合成激酶-3β

2.4大鼠海马组织GSK-3β、STAT3 mRNA表达水平比较 与正常对照组比较，CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组海马组织GSK-3β、STAT3 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与CO中毒模型组、慢病毒空白组比较，GSK-3β低表达组海马组织GSK-3β、STAT3 mRNA表达水平降低(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠海马组织 GSK-3β、STAT3 mRNA表达水平比较

2.5大鼠海马组织GSK-3β、STAT3蛋白表达水平比较 与正常对照组比较，CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组脑组织GSK-3β、STAT3蛋白表达水平升高(P<0.05)。与CO中毒模型组、慢病毒空白组比较，GSK-3β低表达组脑组织GSK-3β、STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见图3和表3。

图3 4组大鼠海马组织GSK-3β、STAT3蛋白免疫印迹图A.正常对照组；B.CO中毒模型组；C.慢病毒空白组；D.GSK-3β低表达组;CO为一氧化碳,GSK-3β为糖原合成激酶-3β，STAT3为信号转导及转录激活因子3

表3 4组大鼠海马组织GSK-3β、STAT3蛋白表达水平比较

3 讨论

CO中毒的某些病理生理学效应与缺血再灌注损伤相一致，因为在两种情况下，均存在一个缺氧阶段，随后通常会进行复氧。研究表明，PI3K/Akt信号通路是脑缺血后主要的凋亡相关信号转导途径，并且该信号通路对细胞存活很重要。在生理条件下，Akt以低活性形式位于细胞质中，当细胞受到细胞外信号刺激(局部缺血或缺氧)时，Akt的C端Ser 473残基会被磷酸化激活，从而调节上游分子。活化的Akt通过多种机制促进细胞存活，主要机制为抑制GSK-3β活性以防止其发挥凋亡作用[6]。既往研究发现，大脑中动脉闭塞后大鼠模型神经元中GSK-3β的表达在缺血和再灌注后的1～3 h有所增加，峰值出现在1 h，这表明GSK-3β信号通路参与早期缺血-再灌注中脑缺血诱导的应激反应[7]。在短暂性全脑缺血和局灶性脑缺血模型中，GSK-3β的水平升高，这可能有助于保护神经元免受致命性缺血性损伤，应用GSK-3β抑制剂后缺血性损伤减轻[8-9]。在90 min的局灶性脑缺血模型(严重缺血)中，GSK-3β被激活以促进细胞凋亡；相反，在5 min整体缺血模型(轻度脑缺血模型)中，GSK-3β失活以促进细胞存活。文献报道，新生鼠缺氧性脑损伤的前24 h最关键，其中神经元凋亡的高峰时间和加重继发性脑损伤的最严重阶段发生在缺氧性脑损伤24 h[10-11]。在本研究中，CO暴露时间为60 min，类似于局灶性严重脑缺血模型，结果显示，与正常对照组比较，CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组逃避潜伏期明显延长，经过原平台位置次数减少、原平台象限停留时间缩短。与CO中毒模型组、慢病毒空白组比较，GSK-3β低表达组逃避潜伏期明显缩短，经过原平台位置次数增多、原平台象限停留时间明显延长。提示靶向抑制GSK-3β基因表达对急性CO中毒大鼠脑损伤神经功能具有保护作用。

文献报道， GSK-3β抑制剂的治疗作用与炎症抑制有关；GSK-3β失活通过调节核因子-κB(NF-κB)和MLK3/JNK信号级联反应抑制小胶质细胞中TNF-α的产生；抑制GSK-3β可诱导抗炎细胞因子IL-10的分泌[12]。本研究结果显示，与正常对照组比较，CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组脑组织神经细胞凋亡水平明显升高；与CO中毒模型组、慢病毒空白组比较，GSK-3β低表达组脑组织神经细胞凋亡水平明显降低。正常对照组海马神经元结构正常；CO中毒模型组、慢病毒空白组海马神经元排列紊乱，坏死明显，可见炎性细胞浸润，伴白色纤维组织增生；GSK-3β低表达组海马神经元坏死数目减少，炎性细胞浸润减少，白色纤维组织增生面积缩小。提示靶向抑制GSK-3β通过抑制CO中毒脑组织损伤后神经细胞的凋亡来减轻神经炎症损伤。体外实验结果表明，脑室内注入SB216763(GSK-3β抑制剂)可显著减轻损伤引起的炎症反应；同时，SB216763处理后还检测到更低水平的细胞凋亡。

STAT家族成员在先天免疫和炎症反应中很重要。有研究显示STAT3及其家族成员在引发脑损伤的炎症反应中起主要作用。同时STAT3也是GSK-3β的靶向下游分子，STAT3的活化促进了GSK-3β通路的激活，随后导致促炎介质的产生和炎症反应[13]。研究表明，免疫和炎症反应在脑缺血性损伤中起关键作用。越来越多的证据表明，STAT3信号通路通过介导炎症反应加剧了脑损伤[14]。此外，在短暂性脑缺血的小鼠模型中和在体外低氧治疗的小胶质细胞中，STAT3的表达水平均上调。有研究报道，STAT3介导的NF-κB途径可激活炎性因子的产生，包括TNF-α、IL-1β和IL-6[15]。本研究结果显示，与正常对照组比较，CO中毒模型组、慢病毒空白组、GSK-3β低表达组脑组织GSK-3β、STAT3 mRNA和蛋白表达水平明显升高；与CO中毒模型组、慢病毒空白组比较，GSK-3β低表达组脑组织GSK-3β、STAT3 mRNA和蛋白表达水平明显降低。提示CO中毒后靶向抑制GSK-3β可抑制STAT3的表达进而抑制促炎性介质的释放。因此，干扰GSK-3β、STAT3表达可能是CO中毒炎症级联反应的治疗目标。

综上所述，靶向抑制GSK-3β基因表达对急性CO中毒大鼠脑损伤神经功能具有保护作用，其机制可能与靶向抑制GSK-3β可下调STAT3的表达进而减轻神经炎症反应有关。