饲料防霉拮抗菌的筛选

文│周启升 马峰（山东省新泰市畜牧兽医事业发展服务中心）鞠瑞成（山东百沃生物科技有限公司）于建（山东农大肥业科技有限公司）刘训理（山东农业大学）

畜禽饲料在储藏过程中十分容易受黄曲霉等霉菌的污染，产生次级代谢物黄曲霉毒素（Aflatoxins），不仅可引起各种动物的急性、慢性中毒，而且具有致癌、致畸、致突变的作用，饲料中黄曲霉毒素在畜禽类产品中聚积，最终也会威胁到人类健康。鉴于此，本研究以黄曲霉等引起饲料霉变的常见霉菌为靶标，利用对峙培养法和抑菌圈法，从泰山土壤中分离筛选出7株饲料常见霉菌的拮抗菌，其中编号为S24的菌株抑菌效果尤为明显，为进一步研究利用微生物之间的拮抗作用及拮抗菌产生的活性物质预防饲料中霉菌的生长与产毒提供参考。

一、材料与方法

1.材料。黄曲霉（Aspergillus flavus），黑曲霉（Aspergillus niger），赭曲霉（Aspergillus alutacells）， 烟曲霉（Aspergillus fumigatus），由国家粮食和物资储备局科学研究院提供。高氏一号培养基、PDA培养基等。

2. 方法。

拮抗菌的分离与筛选。称取采集的营养丰富的泰山土样10克，放入无菌研钵中研碎，加100毫升无菌水制成10-1的土壤稀释液。摇床振荡30分钟，静置5分钟后，吸取上清液1毫升，做系列稀释，梯度依次为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。用移液器吸取50微升土壤稀释液滴于直径为7.5厘米的培养基（细菌分离采用PDA培养基，放线菌分离采用高氏一号培养基）平板中，用无菌涂布器将稀释液涂匀。将接种好的培养皿倒置放入培养箱中，30℃培养，从12小时开始有明显的菌落出现。根据微生物菌落的形状、大小、表面结构、边缘形状、质地、光泽、透明度、颜色和产生的可溶性物等特征，将单菌落一一挑出，转移到相应的PDA培养基平板上培养。若菌落重叠则进行再次分离，直至形成单菌落。

拮抗活性检测。用接种环挑取纯化的菌落，点在距PDA培养基平板中央两端2厘米处，28℃培养48小时后，将长满黄曲霉的平板培养基用打孔器切下直径为5毫米的菌盘接种于PDA培养基平板中央，培养96小时后，观察抑菌情况，测量抑菌带宽度，保留拮抗效果优良的菌株。

发酵液活性检测。将拮抗效果优良的菌株进行复合培养基发酵，获取无菌培养滤液后，将生测培养基熔化后，温度降至55℃时，加入黄曲霉孢子悬液，使黄曲霉孢子的浓度为2×104～4×104CFU/毫升，将培养基孢子悬液倒入培养皿，20毫升/培养皿，制成混菌平板。抗菌物质的生物活性检测采用牛津杯法，十字交叉法测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径大小筛选抗黄曲霉活性高的菌株。

拮抗菌继代培养及保存。对筛选出的拮抗菌连续传代培养10代，重新运用平板对峙培养法测定抗菌活性，保留前后抑菌活性无明显变化的拮抗菌。临时保存采用PDA斜面4℃低温冰箱保存；长期保存接种于干燥、无菌的沙土管，-20℃冰箱保存。

◎图1 S24菌株对饲料中常见霉变真菌的拮抗效果

◎图2 黄曲霉拮抗菌发酵液对黄曲霉的抑制效果

◎图3 S24菌株发酵液对饲料中常见霉变真菌的拮抗效果

二、结果与分析

1.拮抗菌株的分离与筛选。对特殊环境下采取的土样进行分离，获得纯化细菌及放线菌分离株，通过平板对峙培养法进行抗菌活性检测，其中10个菌株对黄曲霉等能引起饲料霉变的常见菌具有较强的拮抗作用。在保留原始分离株的前提下，对各菌株进行10代次的继代培养后，重新测定活性，筛选出具有较强抗菌活性的7个菌株，各菌株对黄曲霉等饲料中常见霉菌的拮抗作用如表1所示，其中S24菌株对引起饲料常见的霉菌具有强烈的拮抗作用见图1。

表1 黄曲霉拮抗菌对霉变真菌的拮抗作用

利用复合培养基对具有拮抗效果的7个菌株进行发酵，测试菌株发酵上清液对黄曲霉的抑制效果如图2，结果显示菌株S24发酵性能较好，发酵液抑菌活性效果见图3，抑菌直径达31～32毫米。

三、结论

目前，对于饲料霉变菌及其毒素的危害，研究集中在毒素脱毒技术的改进及检测方法的优化等主要方面，随着科技的发展，从植物源与微生物源分离活性物质对霉变菌及其毒素的防治正不断引起人们的重视。从饲料安全的角度，利用微生物之间的拮抗作用，探索生物控制方法来预防饲料中霉菌的生长与产毒具有重要意义。本研究提供了一种以危害菌为靶标筛选有益菌的方案，可为其他筛选目标菌的研究提供基本的试验方案，具有较好的借鉴意义。本研究以饲料中常见霉变真菌黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、赭曲霉等为靶标，从泰山土壤中筛选到多株对饲料中常见霉变真菌具有较强拮抗作用的菌株，其中拮抗菌S24及其发酵产生的活性物质对饲料中常见霉菌的拮抗作用最佳，后续研究发现该菌株抗菌谱广、发酵性状优异、遗传稳定，产生的抗菌物质理化性质稳定，具有较好的开发前景。