草莓组织培养育苗技术体系优化

马磊 路远 陈小文 刘艳娇 王海生

摘    要：为进一步优化草莓组织培养育苗技术体系，本试验以日光温室内草莓植株匍匐茎为原材料，研究外植体的消毒接种、启动培养、继代培养、生根培养、驯化移栽等关键技术。结果表明，最佳灭菌处理為75%酒精消毒20 s，0.1%HgCl2消毒3 min，成活率可达97.5%;最佳增殖培养基为MS+0.3 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA，增殖系数3.6，平均株高3.66 cm;最佳生根培养基为MS（大量元素硝酸钾，硝酸铵减半）+25g·L-1蔗糖，生根率100%，平均根长3.65 cm，平均生根数5.7;最佳移栽基质配比为草炭土∶珍珠岩∶蛭石=3∶1∶1，成活率为98%。草莓组培育苗加快繁殖速度，增加繁殖系数，对草莓产业化育苗提供一定的参考价值。

关键词：草莓;组织培养;茎尖;驯化;育苗

中图分类号：S668.4         文献标识码：A           DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.013

Optimization of Tissue Culture System of Strawberry

MA lei1，LU Yuan1，CHEN Xiaowen2，LIU Yanjiao2，WANG Haisheng1

（1. Hebei Fuxiang Seed Technology Co.， Ltd.， Xingtai， Hebei 054000， China; 2.Beijing Zhongnongfutong Horticulture Co.， Ltd.， Beijing 100000， China）

Abstract：In order to further optimize the strawberry tissue culture seedling technology system， the experiment was conducted with the stolon of strawberry in solar greenhouse， the key technologies of explant disinfection and inoculation， start-up culture， subculture， rooting culture， domestication and transplanting were studied.The results showed that the disinfection of the strawberry stem tips with 75% alcohol for 20 s and 0.1% HgCl2 for 3 min were optimal and could reach a survival rate of the tissue up to 97.5%. The optimal medium for proliferation was MS+0.3 mg·L-1  6-BA + 0.1 mg·L-1IBA， the proliferation coefficient was 3.6， and the average plant height was 3.66 cm. The optimal medium for rooting medium was MS （1/2KNO3 and 1/2NH4NO3）+25g·L-1sucrose， the rooting rate was 100%， the average root length was 3.65 cm， and the average rooting number was 5.7. The optimal basic medium was peat∶perlite∶vermiculite at 3∶1∶1 ratio that provided a seedling survival rate of 98%. Comprehensively，strawberry tissue culture could accelerate the propagation speed and increase the propagation coefficient，which provides a certain reference value for strawberry industrialization.

Key words： strawberry; tissue culture; stem tip; domestication; seedling breeding

草莓（Fragaria ananassa Duch.），蔷薇科多年生草本植物，被誉为“水果皇后”，其生长周期短、结果快、成熟早、管理加工容易，在浆果类水果中，栽培面积和产量均占较大比例[1]，其栽培面积仅低于葡萄。据统计，截止2018年，我国草莓种植面积超17万km2[2]，种苗需求量巨大，草莓的繁殖方式成为日渐关注的对象。草莓育苗方法主要是匍匐茎繁殖，但该方法导致积累病毒多、植株矮小、繁殖系数低、产量较低且品种退化严重。随着我国农业的快速发展，草莓的繁殖方式也在不断完善，目前通过组织培养技术繁育草莓苗，可以快速获得大量的草莓种苗，其品质高、植株生长快、繁殖系数高、病虫害少且果实的商品价值和经济价值较高[3]。因此，系统优化草莓高效高产的组培育苗技术，对草莓优质品种繁育，工厂化种苗生产意义重大。本研究通过优化草莓组织培养育苗技术体系，为草莓种苗快速繁殖提供技术支撑，以满足生产用户的需要，也为草莓组培苗产业化生产提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为当年生的草莓幼嫩匍匐茎的茎尖，采集于河北省邢台市南和区南和农业嘉年华草莓日光温室，采集时间在3—5月。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒 匍匐茎清洗：流水冲洗3 min，洗洁精浸泡3 min，轻轻振荡，流水冲洗30 min;加入吐温80（乳化剂T-80）成品浸泡2 min，流水冲洗30 min;转至无菌操作台，灭菌的去离子水清洗2次，75%酒精清洗，0.1%HgCl2清洗，灭菌的去离子水清洗4次。根据酒精和HgCl2的清洗时间设置6个处理（表1）。

1.2.2 启动培养 剥取茎尖：将洗净的匍匐茎放至高温灭菌滤纸上，在显微镜下用解剖针剥开幼叶，剥出0.3 mm左右的茎尖放到培养基中，每瓶2株，每组接种20瓶，茎尖培养采用MS培养基，6-BA 0.3mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，琼脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，pH值调至5.8。

启动培养条件：前3 d暗培养，做遮光处理，3 d后进行光照，光照时长12 h·d-1，光照强度2 500 Lx，温度设置（23±2） ℃。

1.2.3 继代培养 本试验以诱导出的草莓组培不定芽为试验材料，待生长到4～5个叶片后，大约60 d时进行分割，接种到第一代继代培养基中，每瓶3株，每组接种20瓶;后续继代培养以第一代增殖培养60 d后的草莓组培苗为材料，每瓶3株，每组接种20瓶，采用MS培养基，琼脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，pH值调至5.8。

第一代继代培养基设置以下3个处理（表2），后续继代培养设置以下6个处理（表3）。

继代培养条件：光照时长12 h·d-1，光照强度2 500 Lx，温度设置（23±2） ℃。

1.2.4 生根培养 本试验以继代培养组培苗为试验材料，选取生长60 d以上，植株健壮的草莓苗，每瓶4株，接种20瓶，生根培养采用MS培养基，其中大量元素硝酸钾、硝酸铵用量减半，其他营养物质相同，观察生根率，生根数和生根长度。

生根培养：MS培养基，琼脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，硝酸钾，硝酸铵用量减半，pH值调至5.8。

生根培养条件：光照时长12 h·d-1，光照强度2 500 Lx，温度设置（23±2） ℃。

1.2.5 驯化移栽 草莓组培苗生根后直接移栽到大田成活率较低，需要经过驯化移栽阶段。选取根部健壮，根长3～5 cm，生根培养30 d以上的生根组培苗用于驯化移栽。将瓶苗放置温度、湿度皆可调控的连栋温室内7 d，前3 d覆盖遮阳网，避免强光照射，使草莓组培苗逐渐适应自然光和温室环境，第7天下午打开瓶盖加入少量清水，第8天上午移栽至穴盘，移栽穴盘时将根部的培养基洗净，放置0.1%多菌灵溶液中浸泡10 min，移栽至穴盘，盖上保湿盖保湿保温，3 d将盖子上的小孔打开小缝隙，5 d打开小孔一半，7 d打开整个小孔，10 d将保鲜盖掀开，日光温室生长1个月左右，可向大田移栽。

基质成分比例为草炭土∶珍珠岩∶蛭石=3∶1∶1。

1.3 数据统计与分析

文中数据以“均值±标准差”表示，采用SPSS软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 消毒时间对茎尖生长的影响

消毒和灭菌的时间不同，茎尖的成活率和污染率有一定的差异，选择合适的消毒处理时间可以提高茎尖的成活率，图1为吐温和洗洁精浸泡、流水清洗后的匍匐茎。75%酒精和0.1% HgCl2的消毒时间对草莓茎尖生长的影响，试验结果（培养60 d）详见图2。其中，A处理（图2-A）叶片黄绿色，生长不均匀，叶片大小不一，茎显红色，植株生长较弱，成活率77.5%;B处理（图2-B）叶片比较宽大，且不规整，叶片较少，植株矮小，成活率82.5%;C处理（图2-C）叶片生长颜色不均匀，叶片较多，植株较矮小，成活率95%;D处理（图2-D）植株生长茂盛，叶片多且规整，颜色翠绿，植株稍矮，成活率97.5%;E处理（图2-E）茎显红色，叶片较少且颜色不均匀，植株较高，成活率87.5%;F处理（图2-F）叶片稀少且比较嫩黄，植株较矮小，成活率85%。由此可见，D处理，即用75%酒精对草莓匍匐茎消毒20 s，0.1%HgCl2消毒3 min，效果佳，不定芽长势好。

2.2 不同激素对草莓增殖阶段的影响

不定芽的第一代转接，采用3组激素浓度进行对比，生长20 d后，如图3所示，第①组生长较慢，叶片小，植株矮;第②组生长快，叶片较大，茎向上生长;第③组生长慢，几乎没有生长。由此可见，第一代转接适宜采用较高浓度激素的培养基，但是浓度太高也会抑制不定芽的生长。

继代培养以第一代增殖后的草莓组培苗为材料，接种到6组不同种类、不同浓度的激素培养基上，20，40，60 d后观察草莓苗的增殖情况，如图4所示，统计增殖数量，平均株高，计算增殖系数。由表4可知，不同激素处理对草莓的增殖系数影响不同，草莓增殖系数表现为⑤>②>⑥>①>③>④，其中⑤與③、④差异显著，②、⑥与④差异显著，其他处理间差异均不显著;不同激素处理对草莓的株高影响也不同，草莓株高表现为③>⑥>⑤>②>①>④，其中③、⑥和⑤与①和④差异显著。综上可知，在草莓后续继代增殖阶段，处理⑤可作为最优培养基配方。

2.3 生根阶段的分析

生根培养30 d（图5），草莓组培苗的根基本全部长出，从上述生根试验结果计算得到以下数据，草莓组培苗平均生根数5.7条，生根率100%，平均根长3.65 cm，其中最长为6.3 cm，最短为0.9 cm。

2.4 驯化移栽

将上述生根培养30 d的草莓组培苗，在温度和湿度可调控的连栋温室内驯化7 d，第7天下午打开瓶盖并加入50 mL清水，第8天上午移栽至穴盘中，在保湿穴盘内驯化10 d，然后再移栽到穴盘中培养25 d，如图6所示，草莓苗的平均株高13 cm，成活率可达98%。

3 结论与讨论

经过草莓组培育苗试验可知，外植体消毒处理阶段：用75%酒精对草莓匍匐茎外植体消毒20 s，0.1% HgCl2消毒3 min，效果最佳，不定芽长势较好，这与吴正凯等[4]试验结果相近，其匍匐茎处理为75%酒精消毒5～8 s，0.1% HgCl2消毒3 min。增殖培养阶段：第一代转接最终采用6-BA 0.6 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1的激素配比方案，第一代转接组培苗在高浓度下增殖较好，植株生長健壮;后续继代培养基为琼脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，6-BA的最佳浓度为0.3 mg·L-1，IBA的最佳浓度为0.1 mg·L-1，pH值5.8，增殖系数3.6，大多增殖试验都采用6-BA和IBA组合，刘刃等[5]用6-BA、IBA和GA组合，增殖系数较高，而且芽的长势较好。生根培养阶段：琼脂5.8 g·L-1，蔗糖25 g·L-1，其中MS培养基中大量元素硝酸钾、硝酸铵用量减半，其他营养物质不变，生根率100%，平均生根5.7条，平均根长3.65 cm，大多草莓生根培养添加少量的植物激素，董敬超[6]研究的红颜草莓生根培养激素是NAA 0.1 mg·L-1，王燕等[7]研究结果表明适宜的生根培养基是1/2MS+IBA 0.2 mg·L-1，本试验中，草莓组培苗的生根培养可以不添加激素，其生根率也可达到100%。驯化移栽阶段：瓶内炼苗7～8 d，可向基质中移栽，在温湿度可调控连栋温室中培养25 d，成活率98%。

本试验优化了草莓组培脱毒育苗技术的全部过程，为草莓组培快繁提供一定理论基础，草莓组培苗是提高草莓产业经济效益的首要条件，草莓组织培养结合茎尖剥离技术，获得草莓组培苗，可实现草莓的产业化经营[8]。

参考文献：

[1] 郭月玲， 解振强， 王永平. 我国草莓组织培养生产研究现状及前景[J]. 浙江农业科学， 2010（6）： 1211-1215.

[2] 张运涛， 雷家军， 赵密珍， 等. 新中国果树科学研究70年——草莓[J]. 果树学报， 2019， 36（10）： 1441-1452.

[3] 朱丽君， 张馨玉， 袁云香， 等. 草莓组织培养的研究概述[J]. 辽宁农业科学， 2014（6）： 56-58.

[4] 吴正凯， 郑晓峰， 黄刚. 法兰地草莓组织培养快繁技术研究[J]. 内蒙古农业科技， 2009（1）： 32-33.

[5] 刘刃， 吕乐， 竺锡武. 红颊草莓组培标准化及穴盘壮苗研究[J]. 江苏农业科学， 2013， 41（7）： 34-37.

[6] 董敬超.“红颜”草莓茎尖组织培养快繁技术研究[J]. 北方园艺， 2013（24）： 106-108.

[7] 王燕， 陈丙义， 章镇， 等. 黄毛草莓组织培养与快繁技术研究[J]. 西南农业学报， 2012， 25（1）： 252-256.

[8] 李天红， 王岚. 中国草莓生产贸易形势与可持续发展对策分析[J]. 中国农学通报， 2004， 20（6）： 372-375.