多穗柯总黄酮对db/db小鼠胰高血糖素样肽-1分泌的影响

陈敬民　李燕婧

摘要：目的 探讨多穗柯总黄酮对db/db小鼠肠道胰高血糖素样肽-1（GLP-1）分泌的影响。方法 选取db/db雄性小鼠按空腹血糖值随机分组，多穗柯总黄酮以100、200 mg/kg剂量灌胃给药4 w，进行糖负荷GLP-1分泌实验，然后处死动物，取回肠组织，免疫荧光法检测分泌GLP-1的细胞情况，测量食耗量、饮水量、空腹血糖值、血清GLP-1及分泌GLP-1细胞比例。结果 多穗柯总黄酮100或200 mg/kg剂量组均能显著减少db/db小鼠周食耗量（P<0.05或P<0.01）、周饮水量（P<0.01）;降低空腹血糖值（P<0.05或P<0.01）;显著升高空腹GLP-1水平（P<0.01）。多穗柯总黄酮200 mg/kg剂量组能显著升高糖负荷后30、60 min的血清GLP-1水平（P<0.05）;增加分泌GLP-1的细胞比例（P<0.01）。结论 多穗柯总黄酮通过减少肠道L细胞损伤，保护其分泌GLP-1的功能，增加GLP-1的分泌，发挥防治糖尿病作用。

关键词：多穗柯总黄酮;糖尿病;胰高血糖素样肽-1

中图分类号：R285.5   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2021）10-0079-04

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是肠道Langerhans细胞分泌的肠肽类激素，GLP-1能再生和修复胰岛β细胞，增加β细胞数量并抑制其凋亡，提高β细胞质量和数量，改善β细胞功能[1]。通过提高体内GLP-1水平改善胰岛β细胞功能，进而提高胰岛素分泌水平，从而达到防治糖尿病的目的，是药物治疗糖尿病重要作用机制之一。

多穗柯是壳斗科植物木姜叶柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.的干燥嫩叶，富含以根皮苷（Phlorizio-1），三叶苷（Trilobation-2），3-羟基根皮苷（3-hydroxy phlorizin-3）为主的黄酮类物质[2，3]，具有润肺镇咳、滋润肝肾、清热利尿等效用，系广西瑶族地区常用于降血糖的民间草药。本课题组人员曾研究发现其在治疗糖尿病方面有显著的药理作用[4]，本实验利用db/db小鼠糖尿病模型，在考察糖负荷GLP-1变化基础上，结合免疫荧光技术，探讨多穗柯总黄酮防治糖尿病的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级C57、db/db小鼠，雄性，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2016-0010，饲养于广西中医药研究院动物房，实验动物使用许可证号：SYXK桂2016-0006，饲养温度（22±2）℃，环境相对湿度（50±5）%，无菌水，标准鼠料，12小时自由进食/12小时禁食，自由饮水。本实验遵守国家有关实验动物保护与使用准则。

1.2 药物与试剂 多穗柯来源于广西百色，经广西中医药研究院饶伟源主任中药师鉴定为壳斗科植物木姜叶柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun.的干燥嫩叶;盐酸二甲双胍片（批号：190610），北京京丰制药集团有限公司;卓越金采血糖试纸，罗氏血糖健康医护公司;4%多聚甲醛，北京博奥拓达科技有限公司;小鼠胰高血素样肽-1（GLP-1）酶联免疫检测试剂盒，上海仁捷生物科技有限公司;Anti-GLP-1 Rabbit pAb抗体，Cy3标记山羊抗小鼠IgG（红色），细胞核染色剂DAPI，均购自武汉赛维爾生物科技有限公司。

1.3 主要仪器 卓越精采血糖仪（罗氏血糖健康医护公司）;Thermo 1510酶标仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）;Eclipse Ci-L正置荧光拍照显微镜（日本Nikon公司）;Image-pro Plus 6.0图片分析软件（美国Media Cybemetics公司）。

1.4 统计学方法 用SPSS19.0软件进行统计分析，数据以（x[TX-*3/8]±s）表示，采用单因素方差分析，组间进行LSD检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 方法

2.1 多穗柯总黄酮的制备 多穗柯药材粉碎，70%乙醇溶液以10：1液药比回流提取2次，每次2 h，提取液滤过，浓缩成稠膏，用温蒸馏水稀释，上大孔树脂，水、乙醇梯度洗脱，收集50%醇洗脱部分，浓缩，冷冻干燥成粉未，284 nm处检测总黄酮含量为89%。

2.2 实验分组与给药[5] 动物适应性饲养3 d，C57小鼠为正常对照组，db/db小鼠尾静脉针刺取血，血糖仪测空腹血糖值，按血糖值随机分为模型组、二甲双胍83 mg/kg组、多穗柯总黄酮100和200 mg/kg组，每组8只，每笼2只分笼饲养。各给药组灌胃给药，给药体积为20 mL/kg，连续28 d，正常对照组及模型组给予蒸馏水，每周均测量各鼠空腹血糖、食耗量及饮水量。

2.3 糖负荷GLP-1分泌实验[6-7] 末次给药前尾静脉取血，给药1 h后进行实验，各鼠分别按1 g/kg灌胃给予10%葡萄糖溶液，并于口服葡萄糖后30、60、120 min尾静脉取血，血液3000 r/min离心10 min，分离血清，测量小鼠血清GLP-1含量，计算各组小鼠血清GLP-1的均数方差。

2.4 肠组织分泌GLP-1的L细胞检测[8-10] 实验结束后禁食12 h，脱颈椎处死小鼠，冰台上清理脂肪，迅速取回肠组织，4℃生理盐水清洗肠道，置4%多聚甲醛固定24 h，进行修剪、脱水、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、一抗孵育、二抗覆盖、DAPI复染，淬灭封片，荧光拍照显微镜下检查，每张切片选取3个目的区域200倍成像，拍摄GLP-1及DAPI荧光照片，使用图片分析软件分析回肠组织分泌GLP-1的L细胞及其他细胞数，计算分泌GLP-1的L细胞百分率。

L細胞百分率=回肠GLP-1染色区域面积/（GLP-1及DAPI染色区域面积总和）×100%

3 结果

3.1 对db/db小鼠食耗量和饮水量的影响 结果如表1、表2所示，与正常对照组比较，模型组小鼠周食耗量、周饮水量随时间进行性显著增多（P<0.01）。与模型组比较，多穗柯总黄酮100、200 mg/kg组的周食耗量、周饮水量显著减少（P<0.05或P<0.01）。

3.2 对db/db小鼠空腹血糖的影响 结果如表3所示，与正常对照组比较，模型组小鼠空腹血糖随时间进行性显著增高（P<0.01）。与模型组比较，多穗柯总黄酮以100 mg/kg给药7、14 d或以200 mg/kg给药均显著降低空腹血糖（P<0.05或P<0.01）。

3.3 对db/db小鼠血清胰高血糖素样肽1（GLP-1）的影响 结果如表4所示，与正常对照组比较，模型小鼠空腹、口服葡萄糖后血清GLP-1含量明显降低（P<0.01）。与模型组比较，多穗柯总黄酮100、200 mg/kg连续给药28 d显著升高空腹血清GLP-1含量（P<0.01），多穗柯总黄酮200 mg/kg连续给药28 d能显著升高口服葡萄糖后0.5、1.0 h的血清GLP-1含量（P<0.05）。

3.4 对db/db小鼠分泌GLP-1细胞的影响 结果如表5所示，与正常对照组比较，模型组小鼠回肠分泌GLP-1的L细胞数明显减少，肠组织细胞中的比例显著降低（P<0.01）;与模型组比较，多穗柯总黄酮200 mg/kg连续给药28 d明显增加回肠分泌GLP-1的L细胞数，肠组织细胞中的比例显著增加（P<0.01）。肠组织免疫荧光检查结果如图1所示，正常对照组肠组织分泌GLP-1的L细胞层连续光滑、致密，模型组小鼠肠组织分泌GLP-1的L细胞层断续、离散，多穗柯总黄酮100、200 mg/kg连续给药28 d能使db/db小鼠分泌GLP-1细胞层形态连续性、致密度明显优于模型组。

4 讨论

db/db小鼠是C57小鼠4号染色体瘦素受体基因定向敲除引起的一种自发性2型糖尿病模型小鼠，具有和人类2型糖尿病相似的临床症状，有多饮、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗等特征，是理想2型糖尿病模型[11]。与正常对照组比较，模型组食耗量、饮水量及空腹血糖值显著增高（P<0.01）;与模型组比较，多穗柯总黄酮连续给予28 d，db/db小鼠多饮多食的糖尿病症状明显改善（P<0.05或P<0.01），表明多穗柯总黄酮能较好改善db/db小鼠糖尿病症状的作用。

GLP-1受进食、胃肠神经等影响，糖类、脂肪营养物质刺激肠组织增加GLP-1分泌，使外周血GLP-1浓度增高，发挥“肠促胰岛素”作用，并促进胰腺葡萄糖依赖性胰岛素释放，调节体内餐后葡萄糖达到稳态[12-14]。本实验开展口服糖负荷实验，与正常对照组比较，模型组糖后血清GLP-1含量明显降低（P<0.01）;与模型组比较，多穗柯总黄酮连续给药28 d能显著增加小鼠空腹及糖后血清的GLP-1含量（P<0.05）。表明多穗柯总黄酮通过提高分泌GLP-1基础值来发挥GLP-1的降糖作用。

L细胞是肠道分泌GLP-1的内分泌细胞，2型糖尿病GLP-1分泌水平下降与肠道L细胞受损有关[15-16]。本实验对肠组织进行GLP-1免疫荧光分析，正常对照组小鼠分泌GLP-1的L细胞层连续、光滑、致密、比例高;与正常对照组比较，模型组小鼠分泌GLP-1的L细胞层断续、疏散、比例低（P<0.01）;与模型组比较，多穗柯总黄酮连续给药28 d后，db/db小鼠分泌GLP-1的L细胞连续性较好、比例明显增多（P<0.01）。表明多穗柯总黄酮能提高L细胞分泌GLP-1的能力，减少糖尿病小鼠L细胞的损伤。

综上所述，多穗柯总黄酮能显著改善db/db小鼠多饮多食的糖尿病症状，降低空腹血糖值，提高空腹或餐后血清GLP-1水平，减少分泌GLP-1的肠组织L细胞的损伤，表明多穗柯总黄酮通过减少肠道L细胞损伤，保护其分泌GLP-1的功能，增加GLP-1的分泌，发挥多穗柯总黄酮防治糖尿病的作用。

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（收稿日期：2021-07-16）