异尖线虫检测技术研究进展

陈秀琴，刘晓雷，林锋强，白 雪* (1.福建省农业科学院 畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013；.吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 13006)

异尖科线虫属于线虫动物门(Nematode)尾感器纲(Phasmida)蛔目(Ascaridata)，主要包括4个属：异尖线虫属(Anisakis)，伪地新线虫属(Pseudoterranova)，对盲囊线虫属(Contracaecum)及宫脂线虫属(Hysterothylacium)[1]。人通过食用生的、腌制的或未煮熟的含异尖科线虫某些种的活的第三期幼虫的海鱼而引发异尖线虫病[2]。这些线虫主要包括异尖线虫属和伪地新线虫属，偶尔见于对盲囊线虫属[3-4]，其中，异尖线虫属中的简单异尖线虫(A.simplex)和派氏异尖线虫(A.pegreffii)是异尖线虫病的主要病原[5]。

自20世纪60年代由荷兰科学家首次报道异尖线虫病以来[6]，该病已在全球各地均有报道。最新数据表明异尖线虫病在全球的发病率估计为0.000 32%[7]。欧洲食品安全局报道2010年以前全世界大概有20 000异尖线虫病病例，其中高于90%的病例数来自日本[8]。在欧洲，西班牙的异尖线虫病病例数最多，主要是由于当地食用“醋泡凤尾鱼”的习惯。通过定量风险评估发现，西班牙人每餐食用未经处理的生的或腌制的凤尾鱼，可能会摄入0.66条异尖线虫，每进食一餐凤尾鱼感染异尖线虫病的概率为9.56 × 10-5%[9]。

1993年，我国将异尖线虫病列入《中华人民共和国禁止进境的动物传染病、寄生虫病名录》，是我国禁止入境的二类寄生虫病。由于该病无特异性临床症状，因此常被误诊[10]。此外该病也不存在人传人[9]。

随着生食海鱼饮食方式的逐渐流行，异尖线虫病的感染率及发病率可能将有所增长。因此，开展海鱼及其相关产品中异尖线虫的检测工作至关重要。本研究主要对国内外异尖线虫检测技术的研究进展进行综述。

1 异尖线虫的生活史及其在海鱼中的感染情况

1.1 生活史见图1。异尖线虫的成虫寄生于海洋哺乳动物，包括鲸类动物(如鲸鱼、海豚)和鳍足类动物(如海象、海豹)的消化道内[2,11]。雌雄成虫交配产卵并随粪便排入海水中，虫卵在海水中孵化，经两次蜕皮后发育为第三期幼虫(L3)。第二期幼虫(L2)可在海水中存活3～4个月，此时，小型浮游甲壳类动物为储存宿主，在储存宿主体内，幼虫仍然具有感染性，但不继续发育[12]。感染了异尖线虫幼虫的甲壳类动物被海鱼或头足类动物捕食，在消化过程中释放L3幼虫，并移动到肠系膜和肌肉，被捕食后再转移到其他中间宿主。此时，中间宿主携带的L3幼虫对人类和终末宿主已经具有感染性。终末宿主海洋哺乳动物捕食中间宿主鱼或鱿鱼，L3幼虫在胃黏膜中发育为成虫[2,13]。

图1 异尖线虫的生活史

1.2 海鱼中异尖线虫的感染情况异尖线虫分布十分广泛，中间宿主(海鱼类、头足类)和终末宿主(鲸类、鳍足类)的感染在世界各大水域均存在。据报道有200种鱼类和25种头足类动物寄生异尖线虫[14]。感染率较高的海鱼主要有鳕鱼、鲱鱼、岩鱼等，此外鲑鱼、鲭等也有感染的报道[13]。

1992年，我国首次从进境海鱼中检出异尖线虫。随后，山东等多个地区均从海鱼体内检出异尖线虫，且感染率较高。对我国台湾海峡的海鱼进行异尖科线虫感染情况调查，采用形态学结合分子生物学方法检测190种鱼506尾鱼，结果表明有138种鱼感染异尖科线虫，对其中45种鱼感染异尖科线虫幼虫做进一步鉴定，共发现8种异尖线虫，其中宫脂属线虫具有较高的感染率和较强的感染强度，五点斑鲆(Pseudorhombusquinquocellatus)和杂斑狗母鱼(Synodusvariegat)异尖线虫幼虫感染强度均较高[15]。KONG等[16]对中国东海域的带鱼、小黄花鱼、马鲛鱼进行异尖科线虫感染情况调查，发现感染率高达95.1%(116/122)，7种属于异尖属和宫脂线虫属(Hysterothylacium)，其中84.8%为派氏异尖线虫，0.6%(4/619)为简单异尖线虫，1.5%(9/619)为典型异尖线虫，表明我国东海海鱼以感染A.pegreffii为主。林陈鑫等[17]对福建省沿海3大渔场的海鱼进行异尖科线虫幼虫感染调查，解剖32种海鱼共810尾，结果发现异尖线虫幼虫感染率为34.2%(277/810)，不同海鱼的感染程度存在差异，带鱼、马鲛鱼、海鲫鱼和包公鱼的感染率较高，分别为 85.6%(95/111),63.5%(47/74),36.7%(67/162),36.7%(18/49)。总体来看，我国近海海鱼的异尖科线虫感染程度较为严重，应进一步加强防控。

2 危害

异尖科线虫对人体的危害可概况为两方面：破坏消化道和引起过敏反应。幼虫一旦进入人体，约93.2%寄生在胃部，2.6%寄生在肠道，其余部位几乎可以忽略[18]。急性感染时，寄生在胃部的幼虫会导致明显的上消化道症状，如6 h内突然出现腹痛，而寄生在肠道的幼虫较少引起肠道症状[19]。慢性感染时，幼虫钻入胃肠壁黏膜，损害胃肠壁，造成溃疡、嗜酸性肉芽肿[20]。

另一方面，异尖线虫可引起过敏反应，其中简单异尖线虫是引起过敏反应最主要的虫种[21]。目前已经从虫体及其分泌物中发现了14种过敏原，其中Ani s 1(24 kDa)和Ani s 7(139 kDa)是最重要的过敏原[13,22]。这些过敏原在高温和低温条件下都非常稳定。有文献报道，用被异尖线虫污染的鱼粉配制饲料并饲喂畜禽，人通过食用畜禽肉甚至能引起过敏[23]。过敏反应一般发生在食用被异尖线虫幼虫污染的食物60～120 min后，以血管性水肿、荨麻疹和超敏反应综合征为临床症状[24]。异尖科线虫不仅危害人类身体健康，还会导致消费者抵制海鱼产品，对渔业造成巨大的经济损失[25]。

此外，异尖线虫还具有一定的科研价值。由于自然界中的各种生物都是相互关联的，一种生物发生变化具有一定的指示意义。异尖线虫种类及流行病学发生改变可以用来预测全球气候变化和海洋生态变化[26]。例如，简单异尖线虫的整个发育周期受水温的影响[27]。随着海水温度的升高，该虫种的生存范围可能会扩大到其他新海域，进而导致更多的海鱼感染异尖线虫[28-29]。还有文献报道，海洋中的异尖线虫能够富集更多的重金属从而有助于海鱼的生存，因此异尖线虫可指示环境中重金属的污染程度[30]。

3 检测技术

目前，异尖线虫的检测技术主要包括物理学方法(灯检法、紫外光-压片法成像技术)、酶解消化法和生物学方法(免疫学方法、分子生物学方法和蛋白质组学)。

3.1 灯检法该方法是目前工厂检测海鱼中异尖科线虫的主要方法。包括日光灯检法和紫外灯检法。日光灯检法适用于诸如鳕鱼等白色鱼肉的检测。靠近鱼片表面的异尖线虫呈现出红棕色或乳白色，而嵌入深层肉的虫体呈现阴影。紫外灯检法适用于诸如马哈等红色鱼肉的检测。若鱼肉中含有虫体则被激发出荧光[31]。该方法受鱼片厚度、形状、质地、颜色和鱼品种等多种因素的影响，且结果的判定需要专业技术人员[32]。

3.2 紫外光-压片法(UV-Press)该方法是将紫外光灯检法与压片法结合起来的方法。具体操作方法是将海鱼切成1～2 mm薄片，置于透明袋中用压片设备将鱼片压实，将鱼片放在-18℃冷冻至少12 h，在366 nm紫外线的照射下观察是否有幼虫[33]。异尖线虫幼虫发明亮的荧光，因而容易被检测[34]。该方法的检测准确度明显高于灯检法，能将灯检法不能检测到的50.9%幼虫检测到[34]。

3.3 酶解消化法该方法是利用蛋白酶对海鱼和虫体消化能力的差异，结合过滤、沉降等手段从而将虫体分离出来，用肉眼或者显微镜观察，最终确定虫种[35]。该方法适用于实验室。对紫外光-压片法和酶解消化法进行比较，结果表明紫外光-压片法的准确度和灵敏度均可达到100%，而酶解消化法的准确度和灵敏度分别为98%和96%，紫外光-压片法的重复性略高于酶解消化法[36]。因此酶解消化法的准确度、灵敏度和重复性与紫外光-压片法均相当。

3.4 免疫学方法目前发现的异尖科线虫的抗原包括虫体抗原、排泄分泌抗原和表面抗原[37]。异尖科线虫相关免疫学方法的研发多数基于虫体抗原和排泄分泌抗原。免疫学方法的应用包括异尖科线虫抗原检测及异尖线虫病诊断两方面。

传统的检测方法如目检法、压片法、酶解消化法都是基于虫体的形态学，对于深加工鱼产品如鱼酱、沙拉、罐头等则不适用，这些食品蛋白质含量很高，用免疫学方法检测更合适[38-39]。例如，WERNER等[40]建立的夹心ELISA 方法可实现对鱼产品和海鲜中简单异尖线虫蛋白的定量，检测限度为每克样品检出1.1 μg虫体蛋白。KOCHANOWSKI等[39]分别建立了化学发光夹心ELISA法和化学发光竞争ELISA法用于检测食品中简单异尖线虫，分别用0.05，0.5，5.0，50.0，100.0，200.0，300.0，400.0 μg/L的简单异尖线虫抗原人工污染鱼罐头，经高压蒸汽处理(100℃ 60 min)，证明两种方法的检测限度分别为0.5,5.0 μg/L，批内准确度(CV%)分别为1.5%～4.3%，5.1%～7.5%，批间准确度(CV%)分别为2.7%～7.7%，6.2%～13.5% ，表明所建立的化学发光夹心ELISA法更适合用于检测简单异尖线虫抗原。

3.5 分子生物学方法

3.5.1PCR技术 由于通过形态学不容易鉴定线虫，而PCR等分子生物学方法具有灵敏度高等优点，近些年来已经被应用于寄生虫的检测。因此，有人建议应用PCR方法对靶标18S核糖体RNA位点的序列同源性进行线虫鉴定。选择特异性靶基因是设计引物的关键，通常用线粒体DNA(mtDNA)的cox1基因[41]、cox2基因[42]，小核糖体RNA(ssrRNA)，核糖体大亚基(lsrRNA)，核糖体DNA(rDNA)的转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS1、ITS2)鉴别异尖科线虫[43-44]。PAOLETTI等[45]选用rDNA的ITS和mtDNA的cox2、rrnS基因分别设计引物，通过PCR及测序成功鉴别派氏异尖线虫、简单异尖线虫和二者的复合虫体。TIMI等[43]用rDNA的ITS-1、ITS-2和mtDNA 的cox2基因分别设计引物，建立了用于鉴别伪地新线虫属的PCR方法，用该方法结合测序和进化树分析首次证明西南大西洋海域的海鱼寄生伪地新线虫属L3幼虫。

荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)可定性和定量分析结果，灵敏度比普通PCR高。该技术已被应用于检测异尖科线虫。RT-PCR包括探针法和荧光染料法。FANG等[46]基于rDNA的ITS-2序列建立了检测派氏异尖线虫的Taq Man RT-PCR方法，并证明具有高度特异性。PAOLETTI等[47]建立了鉴别异尖属和伪地新线虫属的RT-PCR方法，该法能够鉴定A.simplex(s.s.)，A.pegreffii，P.decipiens(s.s.)，P.krabbei和P.bulbosa5种异尖属虫种。用荧光染料SYBR Green建立的RT-PCR方法也可用于海鱼及海鱼产品的异尖线虫的定量分析，检测限度为每克食品基质检测0.3 ng 的A.simplex(s.l.) DNA[48]。此外，多重RT-PCR也应用于检测异尖属和伪地新线虫属，检测限度分别为0.32,1.60 μg/ L[49]。

3.5.2环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP) LAMP技术具有反应时间短，操作简便等优点。CAMMILLERI等[50]报道用LAMP技术可鉴别异尖属、伪地新线虫属和宫脂线虫属，灵敏度比RT-PCR低100倍。

3.5.3联用技术 有些异尖线虫并非只包含一种虫种，例如，A.simplexs.1.包含派氏异尖线虫、简单异尖线虫和二者的复合虫体，因此，分子生物学方法还需要与其他技术联合应用才能更好地鉴别异尖线虫。例如，PCR技术结合限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)技术或单核苷酸构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)能够提高鉴别类似种属寄生虫的准确度[51]。RFLP 方法利用Hinf、TaqⅠ酶切ITS序列，AccⅠ和AvrⅡ 酶切mtDNA的cox2基因，TscAⅠ、Hin1Ⅱ酶切β微管蛋白基因可以鉴别异尖线虫属的多个虫种[52]。GMEZ-MATEOS等[52]分别扩增rDNA 的ITS1-5,8S-ITS2序列、mtDNAcox2基因和高保守的β微管蛋白基因，随后分别进行RFLP，该方法能鉴别简单异尖线虫、派氏异尖线虫和二者的复合虫种。PCR-RFLP技术与高分辨溶解曲线(high resolution melting,HRM)技术联用用于鉴别异尖属的派氏异尖线虫和简单异尖线虫两个种[53]。

LAMP技术结合侧向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)具有独特的优势。乔艳等[54]建立的LAMP-LFD可以特异性检测出简单异尖线虫和派氏异尖线虫，整个检测过程只需50 min。

3.6 成像技术

3.6.1高光谱成像技术 该方法是一种无损检测技术，通过结合传统的成像和光谱学，从而获得空间信息和光谱信息，现已广泛应用于多个领域[55]。应用该方法能够无干扰地显示出异尖线虫在鳕鱼鱼片中的位置[34]，且在水产加工厂应用的检出率和灯检法的检出率相当[56]。为了提高该方法的检出率，可以将统计学的图像处理和图谱结合起来分析。

3.6.2紫外线技术 包括紫外成像法和紫外荧光成像法，分别用到紫外线检测仪和CCD成像设备。紫外荧光成像法利用寄生虫荧光特性与鱼肉荧光特性的不同，从而实现检测寄生虫。早在 1970 年就有研究者报道异尖线虫的紫外荧光性质[57]。在360 nm紫外光照射下，异尖线虫幼虫可发出白色荧光，从而与被检鱼肉区分。YANG等[58]建立了基于主成分分析和灰度值分析的紫外荧光成像法，该方法的检出率高于80%。紫外荧光成像法可实现自动化检测海鱼及其产品[59]。

3.7 蛋白质组学蛋白质组学是对蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白质相互作用等进行研究的学科[60]。该方法可用于鉴定和定量细胞的蛋白质组成、细胞的亚组分或细胞在某一时刻分泌物，还可用于阐明生命在生理或病理状态下的变化机制[61]。应用蛋白质组学对寄生虫的特异性蛋白进行鉴定有助于诊断寄生虫病和开发抗寄生虫药。

由于基于核酸检测的分子生物学方法检测到虫体DNA与样品中是否含虫体致敏蛋白并不存在必然关系，只有幼虫分泌的致敏蛋白才会导致过敏反应。因此，检测样品中是否含致敏蛋白至关重要。近年来，蛋白质组学也开始被应用于异尖线虫致敏蛋白的鉴定及定量检测。CARREARA等[62]以Ani s 9蛋白中的多肽作为标志物，采用平行反应监测质谱分析法检测异尖线虫(A.simplex和P.krabbei)，检测时间不到2 h。FASTE等[63]将异尖线虫的血红蛋白(Ani s 13)和SXP/RAL-2蛋白(Ani s 5,Ani s 8,Ani s 9)的多肽作为报告基团，采用无标记的nLC-nESI-OrbitrapMS/MS半定量方法检测缓冲液和三文鱼基质，检测限度分别为1，10 mg/L，而采用LC-TripleQ-MS/MS绝对定量方法检测缓冲液和三文鱼基质，检测限度分别为0.10，2.0 mg/L。由于蛋白质组学方法检测成本高，该方法主要用于验证海鱼及其相关产品中是否含异尖线虫致敏蛋白。

3.8 其他检测技术其他检测方法还包括扩增受阻突变体系PCR技术(amplification refractory mutation system,ARMS-PCR)、核磁共振法和电磁波法等。KIM等[64]建立的ARMS-PCR方法能鉴别简单异尖线虫和派氏异尖线虫，结果与PCR-RFLP和ITS测序完全一致，该法与PCR-RFLP法相比，具有检测快速、操作简单和成本低的优点。

核磁共振法是一种新型的检测异尖科线虫的方法，具有灵敏、不损害鱼产品等优点，但是需要昂贵的硬件设备、专业技术人员，数据采集速度慢(每条鱼需要13 min)，而且也不适用于冷冻鱼产品[65]。

电磁波法是基于含寄生虫的鱼肉区域与无寄生虫鱼肉区域致密性的差异，使得磁场发生变化，从而确定鱼肉中是否含有寄生虫[31]。该方法需要用到超导量子干涉测磁装置(SQUID)，价格昂贵，因而，在实际生产中的应用受到限制。

异尖线虫各种检测方法的比较如表1所示。

表1 不同异尖线虫检测方法比较

4 展望

目前，异尖线虫的检测技术仍然主要依赖传统方法。在欧盟，管理条例(No 2074/2005)要求对海鱼及海鱼产品进行目检，大多数参考实验室采用酶解消化法或紫外光-压片法。总体来看，本研究所罗列的方法均存在局限，很难只要一种方法即可得到检测或鉴定结果，也没有一种方法可作为国际公认的行业标准。在已有的条件下更可取的办法是联合使用不同的检测方法。例如，对于大量检测的样品，可先采用灯检法进行初步筛选，再用酶解消化法等方法进一步验证。同时还要开发更多检测快速、灵敏度高、特异性强的商品检测试剂盒。相信随着分子生物学等技术的不断发展，将会开发出更多异尖线虫检测方法，从而将异尖线虫病的危害降到最低。