维甲酸对成肌细胞细胞周期进程及凋亡的影响

李成绪，马 莉，连 帅，徐 彬，逯静静，李鑫月，李倩茹，杨焕民 (黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163000)

当骨骼肌受到损伤时，机体会自发地修复损伤，而成肌细胞的增殖和凋亡正是这一过程的关键。有研究表明，成肌细胞的增殖能够影响其迁移和存活[1-2]，这说明，骨骼肌损伤的修复可能与成肌细胞的增殖有关。

早有研究表明，当骨骼肌处于损伤状态时，骨骼肌细胞的生长和凋亡对其存活至关重要。一方面，当骨骼肌受到外力刺激时，其细胞内会触发一系列反应，激活干细胞的分裂和分化，从而替代受损细胞，修复骨骼肌；另一方面，这种刺激也导致了骨骼肌的损伤，并提高了骨骼肌细胞的凋亡水平[3-4]，因此，抑制成肌细胞的凋亡与增殖能够影响骨骼肌损伤的修复[5]。目前，在分子和细胞水平上同时研究骨骼肌细胞增殖和凋亡的报道较少。PING等[6]关于血管平滑肌的研究发现，抑制细胞凋亡和促进细胞增殖可以改善骨骼肌的生长，此研究确定了影响骨骼肌细胞增殖和凋亡的关键分子及它们之间的相互作用。

全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)是维生素A代谢的中间体，有研究表明ATRA可诱导肢体畸形发育[7-9]。同时，ATRA也是骨发育的重要调节因子，可调控多种骨细胞的增殖和凋亡。本研究旨在阐明ATRA调控成肌细胞增殖和凋亡作用的分子机制，为肌肉损伤的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系与主要试剂本试验所用C2C12细胞系购自北京北纳生物公司；ATRA和DMEM培养基购自Sigma公司；Ccnd1、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1、CDK2、CDK4、CDK6、Bax、Bcl-2、Caspase-3及Ki67抗体、HRP标记二抗购自Proteintech公司；EdU、MTS、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.2 C2C12细胞培养C2C12细胞用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素(Gibco，Rockville，MD，美国)的DMEM(Hyclone，Logan，美国犹他州)培养，培养条件为37℃，5% CO2。将细胞分为2组：第1组正常培养，记作对照组；第2组使用ATRA处理24 h，ATRA终浓度为100 nmol/L，记作ATRA组。

1.3 MTS分析按照MTS试剂盒说明书检测C2C12细胞的增殖活性。接种C2C12细胞于96孔板，待其贴壁后，将培养液换为含有100 nmol/L ATRA的细胞培养液，处理45 h，向每孔细胞中加入20 μL MTS试剂，37℃孵育3 h。使用酶标仪检测490 nm处的D值，每组至少重复3次。使用DMSO溶解ATRA，对照组添加相同浓度的DMSO。

1.4 细胞周期分析接种C2C12细胞于96孔板，待其贴壁后，向细胞中加入ATRA，使其浓度为100 nmol/L，45 h后收集细胞，在4℃的70%乙醇中固定12 h。随后，用PBS洗涤细胞，用0.5 mL PI/RNase染色缓冲液(BD Biosciences，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)在室温下染色15 min，通过流式细胞仪分析细胞周期。

1.5 细胞凋亡检测按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行试验。用100 nmol/L ATRA处理C2C12细胞48 h，每组取1×105个细胞，加入195 μL结合液重悬，向细胞中加入5 μL AnnexinV-FITC，轻轻混匀后再加入10 μL PI染色液，孵育30 min。用流式细胞仪(Beckman，美国)检测凋亡率。

1.6 Western blot检测凋亡相关蛋白表达提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE。将凝胶中的蛋白通过半干法电转至PVDF膜上，于5%脱脂奶粉溶液中室温封闭1 h，随后用以下一抗4℃孵育过夜：Ccnd1、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1、CDK2、CDK4、CDK6、Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin(作为内参)，用TBST洗尽一抗，用HRP标记二抗(1∶10 000)室温孵育1 h，用TBST洗涤5次，增强化学发光法成像，用Image Pro Plus 5.0软件进行图像分析。

2 结果

2.1 ATRA对C2C12细胞增殖活性的影响MTS结果表明，ATRA组的增殖活性显著增强(图1A)。同样，Ki67(细胞增殖的标志物)免疫荧光染色及EdU检测结果显示，与对照细胞相比，用ATRA处理后，C2C12细胞的增殖活性显著增强(图1B，C)。

A.ATRA对C2C12细胞增殖活性的影响；B.C2C12细胞中Ki67表达的免疫荧光检测；C.EdU分析测定C2C12细胞的增殖。**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。下同图1 ATRA对C2C12细胞增殖的影响

2.2 ATRA对C2C12细胞周期的影响检测ATRA处理45 h对细胞周期蛋白D1(Ccnd1)、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1和CDK2、CDK4、CDK6表达的影响。结果显示，ATRA能够显著增加上述蛋白的表达水平(图 2)，表明ATRA能够促进C2C12细胞从G1期到S期的转换，加快了细胞周期进程。

A.Western blot检测ATRA对C2C12细胞周期相关蛋白表达的影响；B，C.Western blot检测所得条带的灰度值分析图2 ATRA对C2C12细胞周期相关蛋白的影响

2.3 ATRA对C2C12细胞增殖进程的影响通过流式细胞术检测ATRA对C2C12细胞增殖进程的影响。结果显示，ATRA能够提高C2C12细胞中处于S期细胞的比例，并降低处于G1期细胞的比例(图 3)，表明ATRA能促进C2C12细胞的增殖。

A.ATRA处理对C2C12细胞增殖进程的影响；B.ATRA处理对不同时相C2C12细胞存活率的影响图3 ATRA对C2C12细胞增殖进程的影响

2.4 ATRA对C2C12细胞的凋亡率及凋亡相关蛋白表达的影响检测了ATRA对C2C12细胞凋亡水平的影响。如图4A，B所示，ATRA降低了C2C12细胞的凋亡率。通过Western blot方法检测C2C12细胞中凋亡相关蛋白的表达水平，如图4C～F所示，与对照组相比，ATRA处理组的Bax表达水平及活化的Caspase-3显著降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平升高，进一步证实了ATRA对C2C12细胞的抗凋亡作用。

A，B.流式细胞术检测ATRA对C2C12细胞凋亡水平影响；C～F.Western blot 检测凋亡因子Bcl-2、Bax及活化的Caspase-3蛋白质水平图4 ATRA对C2C12细胞的凋亡状态及相关蛋白表达的影响

3 讨论

越来越多的研究证实骨骼肌的再生潜力主要归因于成肌细胞增殖的激活[10]，然而肌细胞的凋亡对于骨骼肌损伤修复的影响仍然不能忽视。尽管已有关于影响骨骼肌再生的转录因子的研究[11]，但是维生素代谢产物对于成肌细胞的调控机制仍然未知。本研究发现ATRA在成肌细胞中调控增殖和凋亡，推测ATRA可能促进了骨骼肌的再生和修复。

ATRA是维生素代谢的重要环节，是一种分泌型的信号转导分子，可诱导软骨细胞增殖。有研究表明，向在软骨中表达人类ATRA基因的转基因小鼠腹腔注射BrdU，可诱导软骨细胞增殖，并加速细胞周期从G1期到S期的转变[12]。细胞周期受细胞周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶CDKs所调节[13]，D型细胞周期蛋白，包括Ccnd1、Ccnd2和Ccnd3，是哺乳动物细胞增殖的关键分子，与CDK4或CDK6一起调节细胞由G1期进入S期，Ccne1与CDK2也参与G1/S进程[14-15]。已有研究证明ATRA可以促进鹿茸软骨细胞的增殖及分化[16]。本研究发现，ATRA显著增加C2C12细胞中Ccnd1、Ccnd2、Ccnd3、Ccne1、CDK2、CDK4和CDK6的表达，同时使C2C12细胞的增殖显著增强，这对骨骼肌细胞的生长至关重要。

细胞凋亡是维持机体稳态和正常发育的重要功能。有研究发现，ATRA可以通过抑制细胞凋亡调控各种肿瘤，如乳腺癌、骨癌、肝癌及肺癌等[17-18]。相反，ATRA的活性效应也可能是抑制细胞生长并诱导凋亡的结果。比如，ATRA可以诱发小鼠胚胎芽的凋亡进而使肢体畸形[19]。然而在本研究中，ATRA减少了成肌细胞的凋亡并降低了促凋亡因子Bax的表达及Caspase-3的活化，这可能与ATRA对成肌细胞增殖的促进作用有关。

综上所述，本研究在细胞水平探讨了ATRA影响成肌细胞增殖及凋亡的机制，证实了维生素代谢产物对骨骼肌损伤修复及再生中发挥的重要作用。这提示我们尝试从维生素代谢产物的方面着手，寻找治疗或预防人类和动物肌肉损伤的方法，并为骨骼肌细胞的发育和损伤修复提供理想模型。