外泌体介导小反刍兽疫病毒疫苗株N75-1在细胞间的传播

张乐言，万阳丽，王婉泽，许其华，马楠謌，王晶钰，齐雪峰* (.西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 700；.山东省利津县动物疫病防治监控中心，山东 利津 57400)

小反刍兽疫(peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)所引起的一种跨境性传染性疾病。该病毒侵染对象广泛，除了山羊等小反刍兽，许多家养和野生的动物都表现出对PPRV易感[1-3]。由于PPR具有高致死率的特性，加上长期的地方流行，该病已经成为阻遏发展中国家畜牧业发展的重大疫病之一[4-6]。因此，探究PRRV的传播及致病机制，对PPR防控具有重大意义。PPRV是线性单股负链RNA病毒，其感染宿主后会抑制宿主的免疫反应[7-12]。前期研究证实PPRV侵入机体后，首先侵染宿主的上皮细胞和淋巴细胞，受感染的淋巴细胞通过淋巴和血液循环在宿主体内扩散传播，进而引起炎症反应[13-20]。

外泌体是由细胞分泌的一种纳米级囊泡，大小为30～130 nm，主要来源自细胞多囊泡体内陷，包含多种功能性物质，如蛋白质、mRNA和miRNA等，是细胞转运物质的重要载体。近年研究表明，这些物质均参与细胞间通讯和病原体转移等过程[21-25]。自1983年外泌体首次被发现以来，始终被认为只是细胞间转运物质的一种载体。直到2003年，GOLUDS等[26]根据研究结果提出了“特洛伊木马-外泌体假说”，认为病毒能“挟持”外泌体包裹致病蛋白、基因组等病毒组分，并转运到全身各处，引起大规模地扩散感染，为研究病毒扩散机制提供了新的方向。研究表明，病毒利用外泌体在细胞间扩散可以逃避宿主自身的免疫作用，并导致免疫功能失调，造成病毒扩散及产生免疫抑制[27-28]。通过对丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)等有囊膜病毒的研究，证明外泌体可以携带病毒的全部或部分基因组，在外泌体吸纳细胞中建立增殖性感染，促进病毒的传播，而且，外泌体介导的病毒传播可能是病毒逃避宿主免疫作用的一种途径[29-30]。目前，有关PPRV致病机制的研究有很多，但是PPRV在细胞间传播机制却还不十分清楚。我们的前期研究表明，PPRV侵染细胞会导致宿主细胞外泌体分泌水平升高[31]，提示PPRV侵染后可能会利用外泌体在宿主细胞间进行传播。

本研究旨在分析PPRV-exosome的特征并进一步探究外泌体在介导PPRV细胞间传播过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 病毒及细胞本研究所用毒株为PPRV疫苗弱毒株(N75-1)，由本实验室扩增保存。所用细胞为Vero细胞(CCL-81)，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所惠赠，并由本实验室传代保存。

1.2 主要试剂DMEM培养基为美国Hyclone公司产品；RIPA蛋白裂解液为碧云天生物公司产品；胎牛血清为Gibco公司产品；胰蛋白酶为上海闪晶生物公司产品；荧光定量PCR试剂盒为北京全式金公司产品；CD81抗体、CD63抗体为Santa Cruz公司产品；FITC标记二抗为AbClon公司产品；Hoechst 33342、Triton X-100为北京索莱宝产品；牛血清白蛋白(BSA)为北京博奥拓达科技有限公司产品；GW4869为Sigma公司产品。

1.3 病毒感染分别用MOI=1，5，10的PPRV接种Vero细胞，间隔20 min摇晃，吸附1.5 h后弃掉培养液，同时设置阴性对照(Mock组)，将培养板置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.4 外泌体提取及纯度检测利用梯度超速离心法提取外泌体，具体操作：将细胞上清以300 r/min离心10 min，弃沉淀；2 000 r/min离心10 min，收集上清；10 000 r/min离心10 min除去细胞碎片，收集上清。将上清液用0.22 μm过滤器过滤，利用Exosome(外泌体)抽提试剂盒对外泌体进行进一步分离和纯化，具体步骤按照试剂盒说明书进行。利用透射电子显微镜及Western blot检测外泌体纯度。

1.5 Western blot分析在各组待测样本中加入RIPA裂解液，4℃裂解20 min，提取蛋白进行SDS-PAGE，通过半干转法将蛋白质电转至PVDF膜，用5%的脱脂牛奶室温封闭4 h，封闭结束后，TBST洗涤3次，加相应的一抗溶液(CD63 1∶200，CD81 1∶200)，4℃过夜孵育，TBST洗涤5次，加二抗溶液(1∶5 000)，室温孵育1 h，加入ECL发光试剂显色，采集图像。

1.6 激光共聚焦分析将 PPRV-exosome与正常的细胞进行共孵育，对病毒N蛋白进行荧光标记，利用激光共聚焦显微镜检测细胞中N蛋白表达情况，具体过程：将细胞(对照组和PPRV感染组)用4%的多聚甲醛室温固定15 min，弃固定液，用PBS洗涤3次；加入0.5% Triton X-100，室温处理10 min，PBS洗涤3次；加入5% BSA，室温封闭2 h，PBS洗涤3次；加入一抗(抗N蛋白抗体 1∶1 000)，4℃过夜孵育，PBST洗涤4次；加入FITC标记的二抗，室温条件下，孵育1.5 h，PBST洗涤4次；用Hoechst 33342染细胞核5 min，PBST洗涤4次；利用激光共聚焦仪器成像，观察N蛋白表达情况。

1.7 RT-PCR法检测外泌体中PPRV核酸水平通过RT-PCR检测外泌体中是否包含PPRV基因组，具体步骤如下：用 TRIzol试剂分别提取外泌体RNA以及与外泌体共孵育的受体细胞总RNA，通过反转录获得cDNA，以得到的cDNA为模板，根据PPRV基因组序列设计引物，进行PCR扩增。反应体系：模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，TaqMix 2 μL，以ddH2O补足20 μL。反应程序：95℃预变性30 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min。通过琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，使用凝胶成像仪成像并保存。

1.8 qRT-PCR法检测PPRV核酸以1.7中获得的cDNA作为模板，通过qRT-PCR分析细胞内及培养上清中PPRV核酸水平。反应体系：模板2 μL，上下游引物各0.4 μL，2×TransStare Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，以ddH2O补足20 μL。反应程序：94℃预变性30 s；94℃变性5 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，40个循环。

1.9 GW4869处理细胞抑制外泌体分泌通过细胞毒性检测CCK-8法确定外泌体抑制剂GW4869的工作浓度。根据文献[31-32]，用0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μmol/L GW4869处理Vero细胞，根据细胞毒性检测试验结果，确定接下来试验中GW4869的工作浓度为1.0，5.0，10.0 μmol/L。用上述浓度的GW4869预处理细胞，24 h后接种PPRV，并且设置对照，通过Western blot检测细胞内N蛋白的表达水平；用不同浓度(1.0，5.0，10.0 μmol/L)GW4869预处理细胞24 h，接毒后，收集外泌体，将收集到的外泌体与受体细胞共孵育，利用Western blot和qRT-PCR，检测受体细胞内PPRV的复制情况。

2 结果

2.1 外泌体的特征鉴定透射电子显微镜下观察到外泌体呈典型的茶托样结构，直径约为120 nm(图1A)。在纯化后的外泌体中没有观察到游离的病毒颗粒。Western blot结果表明，外泌体样品中检测到外泌体标志蛋白CD63和CD81，且不能检测到PPRV N和V蛋白(图1B)，表明分离提取的外泌体纯度高，且不含有病毒颗粒。qRT-PCR检测结果表明， PPRV-exosome中可以扩增出PPRV全基因组(图1C)。

A.透射电子显微镜鉴定PPRV-exosome形态(标尺=200 nm)；B.PPRV-exosome含有CD63和CD81，且不含有PPRV的N蛋白和V蛋白；C.PPRV-exosome中可以扩增出PPRV全基因组图1 PPRV-exosome的特征

2.2 PPRV-exosome与正常Vero细胞共培养后细胞中PPRV增殖水平将 PPRV-exosome与细胞共孵育72 h，并设置阴性对照组(Mock-exosome)和阳性对照组(PPRV-infection)。在显微镜下观察到，阴性对照组细胞形态正常，呈上皮细胞状；与对照组相比，试验组细胞形态表现异常，出现合胞体型细胞病变(图2A)。在激光共聚焦显微镜下，与Mock-exosome共培养组的细胞中没有检出病毒N蛋白(绿色荧光)，而在PPRV-exosome组和PPRV-infection 组中观察到清晰明亮的绿色荧光(图2B)。Western blot检测结果表明，PPRV-exosome组和PPRV-infection组均检测到PPRV-N蛋白条带，与阳性对照组相比，PPRV-exosome组N蛋白的条带微暗，但无明显差异(图3A)。TCID50检测结果表明：阳性对照组细胞的病毒滴度较高，PPRV-exosome组细胞的病毒滴度略低，但却没有显著性差异，而在阴性对照组细胞中未检测到PPRV病毒颗粒(图3B)。

A.Vero细胞与PPRV-exosome共孵育后细胞出现CPE(100×)；B.免疫荧光检测Vero细胞与PPRV-exosome共孵育后细胞中PPRV-N蛋白(400×)图2 正常Vero细胞与PPRV-exosome共孵育后细胞中PPRV镜检结果

A.Western blot法检测Vero细胞与PPRV-exosome共孵育后细胞中PPRV-N蛋白；B.Vero细胞与PPRV-exosome共孵育后细胞的病毒滴度图3 Vero细胞与PPRV-exosome共孵育后细胞中PPRV-N蛋白及PPRV增殖水平

2.3 外泌体抑制剂处理对PPRV外泌体传播途径的影响根据CCK-8毒性试验结果，确定GW4869的药物浓度为1.0，5.0，10.0 μmol/L，用不同浓度的GW4869预处理细胞后24 h，提取外泌体，Western blot结果显示，随着药物浓度的不断升高，外泌体的标志蛋白CD63表达降低(图4A)。用5.0，10.0 μmol/L的GW4869对细胞进行预处理，培养24 h后接种PPRV，对照组细胞用DMSO处理24 h后接种PPRV，接种后48 h收集细胞和细胞上清，进行Western blot和TCID50检测。结果显示，与对照组相比，不同浓度GW4869处理的试验组细胞N蛋白的条带亮度不显著，表明N蛋白表达量无明显差异(图4B)；TCID50检测发现，经不同浓度GW4869处理的试验组与对照组相比，细胞内病毒滴度几乎相同，无明显差异(图4C)。利用qRT-PCR检测上清液中病毒RNA的含量，结果显示，经过GW4869预处理后，病毒RNA向细胞外的释放水平受到明显抑制(P<0.01)，随着剂量增高，抑制水平也在不断增加(图5A)。提取不同浓度GW4869预处理后PPRV接种细胞分泌的外泌体，将外泌体与Vero细胞共孵育72 h，分别设置PPRV直接感染组和PPRV-exosome共孵育组两个试验组，Mock-exosome共孵育组为阴性对照组。利用qRT-PCR和Western blot技术检测细胞内PPRV增殖情况。Western blot检测结果显示，与阳性对照组相比，试验组N蛋白表达降低，结合qPCR结果可知，试验组Vero细胞中PPRV增殖水平均显著降低(P<0.01)，且呈增殖水平与GW4869使用剂量成反比(图5B，C)。

A.Western blot检测GW4869对PPRV感染Vero细胞外泌体释放水平的影响；B.Western blot检测GW4869对PPRV感染Vero细胞中病毒复制的影响；C.GW4869对PPRV感染Vero细胞中病毒滴度的影响图4 抑制外泌体释放水平对PPRV感染Vero细胞中病毒增殖的影响

A.GW4869对PPRV感染Vero细胞培养上清中PPRV RNA的影响；B.GW4869对外泌体介导的PPRV在Vero细胞内复制的影响；C.GW4869对外泌体介导的PPRV在Vero细胞中病毒滴度的影响图5 抑制外泌体释放对外泌体介导PPRV传播的影响

3 讨论

PPRV是一种有囊膜的线性单股负链RNA病毒，与同属的其他成员间存在结构和遗传上的相似性[32]。由于外泌体具有可以在靶细胞间自由移动的特点，病毒利用外泌体进行扩散可以逃脱宿主的免疫作用，导致免疫功能失调[33-34]。本课题组前期研究表明，PPRV侵染会导致外泌体释放水平增加，提示PPRV侵染后可能会利用外泌体在宿主细胞间传播[31]。

分离提取得到高纯度的外泌体，排除游离的PPRV对试验结果的干扰，是研究外泌体在病毒细胞间传播扩散机制中作用的保证。本研究采用梯度超速离心法提取外泌体，并利用外泌体提取试剂盒对外泌体进行进一步的富集纯化，该方法的可靠性已经在前期试验中得到验证[35]，所得外泌体纯度高，且不含有病毒粒子，符合后续试验的要求。

一些囊膜包裹的RNA病毒在细胞间进行扩散时，可以利用外泌体包裹具有感染性的病毒基因组，促进病毒的扩散[29-30]。本研究结果证实，在PPRV-exosome中，能够检测到完整的PPRV全基因组。合胞体是包膜病毒感染细胞后，出现宿主细胞与同类细胞融合的病变现象。在本研究中，将PPRV-exosome与细胞共孵育，显微镜下观察到细胞有明显的合胞体出现，与PPRV直接感染结果相同；进一步利用激光共聚焦和Western blot检测细胞中PPRV-N蛋白的表达水平，两种试验结果均显示在吸纳细胞中检测到了PPRV-N蛋白的存在，表明PPRV可以利用外泌体包裹具有感染性的基因组，感染吸纳细胞并在细胞内复制。

本研究中所使用的GW4869是一种外泌体抑制剂，该抑制剂可以抑制神经酰胺的产生[36]。神经酰胺在外泌体形成过程中起着关键作用，神经酰胺的抑制会导致外泌体分泌水平下降。DOMENIS等[32,34,37]相继证明了GW4869的使用会导致肠道病毒71、戊型肝炎病毒等病毒的释放水平降低。本研究发现，经过GW4869预处理的细胞接种病毒后，细胞内PPRV的复制并没有受到明显影响，但是PPRV的胞外释放水平却受到了显著的抑制，尤其是PPRV在吸纳细胞内的增殖水平显著降低，并且随着剂量的不断增高，抑制水平也在不断的提高，进一步证实外泌体是PPRV在细胞间传递扩散的一条重要途径。