一种可视化双重荧光RT-LAMP方法鉴别不同毒力新城疫病毒

曾婷婷，谢丽基，谢芝勋，罗思思，李 孟，黄娇玲，张民秀，张艳芳，范 晴，邓显文 (广西壮族自治区兽医研究所，广西 南宁 530001)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由中等毒力或强毒力的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的高传染性、高致病性和高致死性的传染病。NDV可以感染超过250种禽类和鸟类[1]，根据全基因组遗传进化分析，NDV被划分为ClassⅠ和ClassⅡ两大分支[2]，目前引起发病的NDV绝大多数是ClassⅡNDV。世界动物卫生组织(OIE)根据NDV的3个致病指数，将NDV划分为速发型、中发型和缓发型毒株[3]，即通俗称的强毒、中等毒和弱毒。决定NDV毒力的主要基础是F蛋白的前体F0蛋白能否被宿主蛋白酶裂解，所以F0蛋白裂解位点所对应的核苷酸序列可作为判断NDV毒力的分子标志[3]。目前，已有研究者建立了针对这个位点的不同的分子生物学鉴别检测方法，如RT-PCR[4]及qRT-PCR方法[5]等。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是NOTOMI等[6]发明的等温扩增技术，具有使用仪器简单、检测结果可视化、反应时间短等优势，在各种疾病检测中得到了广泛的应用。本研究将分子信标引入LAMP反应体系，设计了一套能同时扩增ClassⅡNDV不同基因型F基因的LAMP引物，同时设计2条针对不同毒力NDV F0蛋白裂解位点对应核苷酸序列的分子信标，建立了一套能够通过反应后观测荧光信号判断NDV毒力的双重荧光RT-LAMP检测方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株本实验使用病毒株均为本实验室保存，具体见表1。

表1 毒株信息

1.2 主要试剂与仪器EasyPure®Viral DNA/RNA Kit，EasyPure®Quick Gel Extraction Kit，EasyScript®One-Step RT-PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；RT-LAMP试剂盒WarmStart®LAMP Kit (DNA & RNA) 购自美国New England Biolabs(NEB)公司；体外转录试剂盒RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems购自美国 Promega公司；超微量分光光度计NanoDrop 2000购自美国Thermo Fisher Scientific公司；LA-320c LAMP实时浊度仪购自北京蓝谱生物科技有限公司；多通道荧光成像仪ChemiDoc XRS+ Imager购自美国BIO-RAD公司。

1.3 引物设计使用MEGA X软件比对不同毒力ClassⅡ NDV的 F基因，选取F基因1～600 bp片段，使用LAMP引物在线设计网站http://primerexplorer.jp/e/v4_manual/index.html进行通用引物设计。使用探针在线设计网站http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/设计探针，在探针左右两端加上茎环序列，形成分子信标。中等、强毒NDV分子信标的5′端标记FAM荧光基团，3′端标记Dabcyl淬灭基团；弱毒NDV分子信标的5′端标记CY5荧光基团，3′端标记BHQ3淬灭基团。

1.4 核酸提取及质粒标准品构建按照核酸提取试剂盒说明书提取NDV毒株及其他毒株的RNA/DNA。使用引物(F:5′-ACTCAATCTATCTGTCGGGCTCA-3′，R:5′-GGCATTCTGGTTGGCTTGTAT-3′)对NDV毒株La Sota和F48E8进行RT-PCR扩增，回收片段后与pMD18-T载体连接，构建质粒后经过SpeⅠ酶切、线性化之后体外转录为ssRNA，测量浓度后计算拷贝数，并保存于-80℃ 备用。

1.5 RT-LAMP方法建立将LAMP引物稀释并合并为引物混合物，各引物浓度：F3 5 μmol/L,B3 5 μmol/L,FIP 40 μmol/L,BIP 40 μmol/L,Floop 20 μmol/L,Bloop 20 μmol/L。RT-LAMP反应体系：2×RT-LAMP mix 12.5 μL，引物各1 μL，模板RNA 1～2 μL，用ddH2O补足25 μL。分别用浊度仪和水浴锅同时进行反应。由于商品化RT-LAMP试剂盒已将各种反应底物优化至最优，因此本试验仅进行反应温度的优化。分别将NDV La Sota和F48E8体外转录的ssRNA片段浓度调整为106copies/μL作为模板，进行单重和双重RT-LAMP反应。单重RT-LAMP反应的模板量为La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL，分别加入不同反应管；双重RT-LAMP反应的模板量为La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL，加入同一反应管。温度设置为60～70℃，每个反应升高1℃，反应时间为60 min，扩增结束后80℃、5 min终止反应，通过浊度仪观测反应起始时间和反应产物的生成效率。

1.6 分子信标的浓度优化在最佳反应温度下，在反应体系中添加分子信标，于0.001～1.000 μmol/L优化工作浓度，使用荧光成像仪观测，使反应后阳性结果荧光强度足够强，阴性结果荧光强度足够弱。

1.7 特异性试验和临床样品检测分别使用表1中的各毒株进行RT-LAMP反应，验证本方法的特异性。随机选取本实验室2017-2018年在广西活禽市场进行NDV流行病学调查采集的拭子样品，提取RNA通过RT-LAMP进行检测，结果与前期的F基因测序结果互相验证。

1.8 敏感性试验和干扰试验将La Sota和F48E8体外转录的ssRNA 10倍梯度稀释为1×107～1×101copies/μL，分别进行单重和双重RT-LAMP反应，单重RT-LAMP反应的模板量为La Sota或F48E8 ssRNA 1 μL，双重RT-LAMP反应的模板量为同浓度的La Sota和F48E8 ssRNA各1 μL。将不同浓度的La Sota和F48E8 ssRNA混合进行双重RT-LAMP反应，检测不同浓度的模板对反应体系效果的影响。浓度组合分别为La Sota 1×106copies/μL，F48E8 1×102copies/μL；La Sota 1×102copies/μL，F48E8 1×106copies/μL；La Sota 1×107copies/μL，F48E8 1×103copies/μL；La Sota 1×103copies/μL，F48E8 1×107copies/μL。以上每个组合的每种模板各1 μL。

2 结果

2.1 引物设计使用LAMP引物在线设计网站和探针在线设计网站，获得一套通用引物和分子信标。LAMP引物在单核苷酸多态性丰富的区域采用了简并碱基，分子信标位于F0蛋白裂解位点对应的核苷酸位点，根据该位点的碱基组合方式，针对强毒、弱毒NDV各设计了2条分子信标，相关信息见表2。

表2 LAMP引物及分子信标信息

2.1 RT-LAMP反应温度及分子信标浓度优化观测不同温度的反应起始时间，结果显示，在65℃时，浊度仪检测到单重和双重RT-LAMP反应对模板的扩增起始时间最早，扩增效率最高。通过添加不同工作浓度的分子信标，反应结果如图1显示，分子信标的工作浓度为0.2 μmol/L时，可获得最优的观测结果。反应后使用荧光成像仪在FAM通道下，强毒为绿色，弱毒无色；在CY5通道下，弱毒为红色，强毒无色。双重RT-LAMP则2个通道都显色，2个通道合并后为黄色，阴性对照则在2个通道下均为无色。

第1排.FAM通道；第2排.CY5通道；第3排.2个通道合并。1～8.阳性对照；9～16.阴性对照。分子信标浓度：1，9.0.8 μmol/L；2，10.0.6 μmol/L；3，11.0.4 μmol/L；4，12.0.2 μmol/L；5，13.0.1 μmol/L；6，14.0.05 μmol/L；7，15.0.025 μmol/L；8，16.0.01 μmol/L图1 不同浓度分子信标的荧光成像图

2.2 特异性试验和临床样品检测以表1中毒株的RNA/DNA为模板进行RT-LAMP反应，检测反应的特异性，结果如图2显示，在浊度仪下，NDV毒株均有扩增，其他病原无扩增；在荧光成像仪下，NDV毒株C/Ulster/67、GX1806quail、GX1802pi-geon和La Sota均只显示红色荧光，其余NDV毒株只显示绿色荧光，其他病原无荧光产生，证明本检测方法可特异性鉴别检测不同毒力NDV。随机选取20份本实验室2017-2018年在广西活禽市场对各种活禽进行NDV流行病学调查时采集的拭子样品[7-8]通过RT-LAMP检测，结果显示，RT-LAMP检测结果与通过对样品进行NDV分离鉴定和分离株F基因测序后推导的强弱毒株结果一致。混合感染不同基因型的样品均能同时显示出2种荧光(图3)。

A.浊度仪观测NDV毒株特异性试验(1.NDV-/Ulster/67；2.NDV-GX1806 quail；3.NDV-GX1802 pigeon；4.NDV-La Sota；5.NDV-Mukteswar；6.NDV-GX1807 spotted dove；7.NDV-GX1808 spotted dove；8.NDV-GX1701 spotted dove)。B.浊度仪观测NDV毒株特异性试验(1.NDV-GX1810 turtle dove；2.NDV-GX1811 turtle dove；3.NDV-GX1812 pigeon；4.NDV-GX1/00；5.NDV-GX6/02；6.NDV-GX9/03；7.NDV-GX12/04；8.NDV-F48E8)。C.浊度仪观测NDV毒株和其他常见禽类病原体特异性试验(1.NDV-GX19/2011；2.NDV-159 Francolinus pintadeanus19；3.NDV-158 Francolinus pintadeanus18；4.IBV-H120；5.AIV- Duck/Guangxi/1/04；6.AIV-A/Duck/42846/07；7.AIV-A/Chinese Francolin/Guangxi/020B7/2010；8.ILTV-Beijing strain)。D.浊度仪观测NDV毒株和其他常见禽类病原体特异性试验(1.Mycoplasma gallisepticum-S6；2.FAdV4-GX001；3.Escherichia coli；4.Pasteurella multocida；5.Salmonella；6.阴性对照)。E.荧光成像仪观测NDV毒株和其他常见禽类病原体特异性试验(1.NDV-/Ulster/67；2.NDV-GX1806 quail；3.NDV-GX1802 pigeon；4.NDV-La Sota；5.NDV-Mukteswar；6.NDV-GX1807 spotted dove；7.NDV-GX1808 spotted dove；8.NDV-GX1701 spotted dove；9.NDV-GX1810 turtle dove；10.NDV-GX1811 turtle dove；11.NDV-GX1812 pigeon；12.NDV-GX1/00；13.NDV-GX6/02；14.NDV-GX9/03；15.NDV-GX12/04；16.NDV-F48E8；17.NDV-GX19/2011；18.NDV-159 Francolinus pintadeanus19；19.NDV-158 Francolinus pintadeanus18；20.IBV-H120；21.AIV- Duck/Guangxi/1/04；22.AIV- A/Duck/42846/07；23.AIV- A/Chinese Francolin/Guangxi/020B7/2010；24.ILTV- Beijing strain；25.Mycoplasma gallisepticum-S6；26.FAdV4-GX001；27.Escherichia coli；28.Pasteurella multocida；29.Salmonella；30.阴性对照)图2 特异性试验

1～23.拭子样品；24.阴性对照图3 双重荧光RT-LAMP检测活禽拭子样品

2.3 敏感性试验和干扰试验La Sota和F48E8体外转录的ssRNA原始浓度分别为2.1×107copies/μL 和2.3×107copies/μL，将它们的浓度都调整为1×107copies/μL后，10倍梯度稀释至1×107～1×101copies/μL。单重RT-LAMP结果如图4显示，对La Sota和F48E8 ssRNA模板的最低检测量均为100 copies/μL，双重RT-LAMP结果显示，对2种模板同时检测的最低检测值也为100 copies/μL。根据反应起始时间可以发现，检测到最低检测浓度模板的时间于30 min内。干扰试验结果显示，对相差104倍的模板浓度，该方法仍能对不同的模板进行有效扩增，达到鉴别检测的目的(图5)。

A.浊度仪观测F48E8敏感性试验 (1.1×107 copies/μL；2. 1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.阴性对照)；B.浊度仪观测La Sota敏感性试验 ( 1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.阴性对照)；C.浊度仪观测2种模板混合敏感性试验 ( 1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.阴性对照)；D.荧光成像仪观测敏感性试验 (第1排.F48E8；第2排.La Sota；第3排.2种模板混合；1.1×107 copies/μL；2.1×106 copies/μL；3.1×105 copies/μL；4.1×104 copies/μL；5.1×103 copies/μL；6.1×102 copies/μL；7.1×101 copies/μL；8.阴性对照)图4 敏感性试验

1.La Sota 1×106 copies/μL；2.F48E8 1×102 copies/μL；3.La Sota 1×106 copies/μL 和F48E8 1×102 copies/μL 混合；4.阴性对照；5.La Sota 1×102 copies/μL；6.F48E8 1×106 copies/μL；7.La Sota 1×102 copies/μL 和F48E8 1×106 copies/μL 混合；9.La Sota 1×107 copies/μL；10.F48E8 1×103 copies/μL；11.La Sota 1×107 copies/μL 和F48E8 1×103 copies/μL 混合；12.阴性对照；13.La Sota 1×103 copies/μL；14.F48E8 1×107 copies/μL；15.La Sota 1×103 copies/μL和F48E8 1×107 copies/μL混合；16.阴性对照图5 干扰试验

3 讨论

LAMP技术发明以来，不断发展改进，从一开始通过观测反应产生的沉淀来判定结果，发展到加入SYBR Green Ⅰ或钙黄绿素、TE等染料观测结果[9-10]，虽然提高了可视性，但SYBR Green Ⅰ往往需要反应后开盖加入，非常容易产生气溶胶污染，且SYBR Green Ⅰ、钙黄绿素、TE等都不能区分扩增产物、引物二聚体和非特异扩增。所以，范晴等[11]在前人研究基础上，通过在FIP上标记荧光基团，反应后通过电泳观测结果，从而消除引物二聚体或非特异扩增所产生的假阳性，且能达到1个反应体系同时鉴别检测2种病原的目的。但这也需要开盖并通过电泳完成，为了达到不开盖观察结果的目的，谢志勤等[12]在LAMP反应体系中引入TaqMan探针，LAMP反应过程中，TaqMan探针与扩增产物结合后再被水解，产生游离荧光基团，反应完成后可通过荧光成像仪观测结果。分子信标是由TYAGI等[11]发明的一种荧光标记的分子探针，具有较高的灵敏度和极强的特异性，分子信标可与实时定量PCR相结合检测目标基因，也可用于双链DNA和蛋白质的检测[14]。本研究使用分子信标与RT-LAMP技术相结合，反应前由于茎环结构，分子信标的荧光基团和淬灭基团靠近，荧光被淬灭，反应后，在80℃温度下分子信标被打开，退火至室温过程中，与目标片段结合，茎环结构打开，荧光基团和淬灭基团远离，发出荧光，通过荧光成像仪的对应通道观测荧光，且无需开盖，防止了气溶胶污染。

NDV的HN、M和P蛋白均可以影响NDV的毒力，但主要影响因素仍然是F0蛋白可否被宿主蛋白酶裂解为F1和F2蛋白，促进病毒囊膜和宿主细胞膜融合从而感染宿主细胞[15]。绝大多数的中等毒力、强毒力NDV的F蛋白裂解位点的氨基酸基序为112R/K-R-Q-K/R-R-F117，而弱毒力NDV的基序为112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117。近年来分离到的鸽源NDV，虽然使用鸡作为致病指数测定的动物，显示为中等毒力或弱毒，但对鸽子仍然表现为强毒[16]。因此，OIE仍然将F0蛋白裂解位点的核苷酸序列作为判断NDV毒力的分子标志，在实际监测中也仍然符合绝大多数的NDV毒力特征。本研究基于这个分子标记设计分子信标，达到鉴别诊断不同毒力NDV的目的。

多年来不同实验室对NDV的监测发现，不同基因型和不同毒力的NDV在同一个个体中共存是非常普遍的现象[8,17-18]，在之前的监测和诊断工作中，鉴别同一个个体是否感染不同毒力的NDV，需要经过RT-PCR扩增和测序等步骤，耗时长且人力、物力需求大，不利于大批量的流行病学调查和诊断。本方法可以快速鉴别不同毒力NDV，且在水浴锅内可完成全部反应，直接通过荧光成像仪观测结果，具有快速、高通量的特点，可以使大规模流行病学调查的效率大大提高。

综上所述，本研究建立的区分不同毒力NDV的可视化双重荧光RT-LAMP检测方法，可以在30 min 内实现在同一个反应管内同时扩增不同毒力的NDV，最低检测量达到100 copies/μL，并且在荧光成像仪下，可以通过不同的荧光色鉴别诊断不同毒力的NDV，为提高NDV的诊断和监测效率提供了新的技术手段，也为在不同试验条件下检测其他病原体提供了新的思路。