牛miR-615潜在生物学功能分析及其组织表达鉴定

2021-10-30丁燕玲王鹏飞杨朝云师丹丹史远刚康晓龙

西北农业学报 2021年10期

丁燕玲,王鹏飞,杨朝云,马应,师丹丹,史远刚,康晓龙

(宁夏大学农学院，银川 750021)

miRNA是一类长度为18～22nt的单链非编码小分子RNA，主要通过种子序列与靶基因的3’UTR区特定序列互补结合，抑制靶基因表达或诱导使其降解，进而调控机体的生物学过程[1-2]。miRNA的功能一般都是负调控，但近期研究表明，miRNA同样也可以促进基因的表达[3-4]，这进一步拓宽了人们对miRNA调控方式的认知。肌肉的生长发育直接影响肉牛的产肉量和肉品质，肌细胞的增殖分化是肌肉组织正常发育的指标[5]，而miRNA是成肌细胞、骨骼肌卫星细胞增殖分化过程的重要调控因素[6-7]。研究发现，miR-1、miR-133和miR-206是3个在肌肉中特异性表达的miRNAs，miR-l、miR-206可以促进成肌细胞的分化，而miR-133则促进成肌细胞的增殖[8-10]。miR-378、miR-143能够分别靶向POLA2和IGFBP5基因调节牛骨骼肌卫星细胞增殖和分化[11-12]；miR-133表达量的上调与巴什拜羊骨骼肌卫星细胞增殖分化状态的转换存在关联性[13]；在小鼠骨骼肌组织中过表达miR-499，Tnni1基因表达量显著上调，Tnni2基因表达显著下调[14]；miR-127-3p通过直接靶向DDIT3基因/转录因子调控免疫与能量代谢类基因的表达，进而调节成肌细胞分化[15]。目前已鉴定出大量miRNAs通过调控相应靶基因和信号通路而影响骨骼肌卫星细胞和成肌细胞的增殖分化，然而miR-615对肌肉发育的研究少有报道。

miRNA靶基因的预测与鉴定是开展相关miRNA功能研究的基础。前期研究基于转录组测序技术挖掘秦川牛剩余采食量(Residual feed intake, RFI)相关RNA分子时，发现miR-615是秦川牛RFI相关关键miRNAs之一，且在高RFI组中表达量上调[16]。由此，笔者推测miR-615及其靶基因可能通过影响饲料消化吸收参与调控牛能量代谢过程，进而调节肌肉的生长发育。因为肌肉组织是机体能量代谢及线粒体呼吸过程中的重要组织之一[17]，如转基因小鼠内N-6多不饱和脂肪酸(N-6PUFA)转化为N-3多不饱和脂肪酸(N-3PUFA)，显著提高体内N-3PUFA含量，肌组织和细胞中N-3PUFA水平的增加促进了细胞内脂肪酸的氧化代谢和糖原合成，但是抑制了葡萄糖的有氧氧化和磷酸戊糖循环，同时线粒体内三羧酸循环和呼吸链复合体活性也显著降低，进而抑制了氧化磷酸化生成ATP[18]。研究表明，miR-615是一种在真核哺乳动物中高度保守的miRNA，它不仅在胚胎发育过程中的成骨和血管形成中参与生长发育的调节，还参与调节细胞生长、分化和迁移，充当肿瘤抑制剂或肿瘤促进剂[19]。在大鼠软骨分化诱导的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)中，miR-615-3p过度表达后相关基因的mRNA表达显著降低，促进软骨形成的转录因子SOX9表达也显著降低，从而抑制了大鼠的软骨分化，而敲除miR-615-3p则得到相反的结果。这表明miR-615-3p抑制软骨细胞特异性基因的表达，并可能抑制软骨细胞分化[20]。在人类肝组织[21]、前列腺癌细胞[22]以及胰腺癌细胞[23]中，miR-615-5p通过抑制相应基因的表达或信号通路而抑制癌细胞增殖、迁移，但其在肌肉发育过程中的功能尚不明确。因此，为研究miR-615在牛肌肉发育过程中的潜在作用与功能，利用已有数据库对牛miR-615的靶基因进行预测，并对其基因本体(Gene ontology,GO)和信号通路(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)进行富集分析；之后采用qRT-PCR法分析miR-615在牛主要机体组织中的表达模式，初步了解miR-615可能参与的生物学调控途径及潜在功能，为进一步开展miR-615在牛肌肉发育过程中的调控机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 miR-615在不同物种间的保守性分析

从NCBI数据库中检索出牛miR-615的序列，并与人(Homosapiens, has)、猕猴(Macacamulatta, mml)、小鼠(Musmusculus, mmu)、马(Equuscaballu, eca)、猩猩(Pongopygmaeus, ppy)、犬(Canisfamiliaris, cfa)等11个物种的miR-615序列进行比对，分析其在各物种间的保守性。

1.2 miR-615靶基因预测及功能富集分析

为了降低miR-615靶基因预测结果的假阳性，采用TargetScan、miRWalk和miRDB 3个在线软件预测miR-615的靶基因，用软件Veney绘制韦恩图，得到3个数据库预测结果的交集，然后集合miRTarbase数据库中经试验验证的靶基因组成下一步分析的基因集合；通过DAVID数据库对预测到的miR-615靶基因集合进行GO、KEGG富集分析，以P<0.05为显著性阈值。所用数据库见表1。

表1 数据库名称及网址Table 1 Name database and website

1.3 miR-615在牛各组织中的表达量分析

1.3.1 试验材料选取宁夏某养殖场健康状况良好、16月龄左右、体质量相近的3头秦川公牛为试验对象，屠宰后采集心、肝、脾、肺、肾等8个组织，带回实验室，置-80 ℃冰箱保存，备用。

1.3.2 试验试剂根据天根生化科技(北京)有限公司RNA试剂盒说明书提取各组织RNA，分光光度计检测RNA浓度和纯度，检测合格后备用。反转试剂盒(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)购自TakaRa公司，荧光定量试剂盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3.3 总RNA提取及反转录提取心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、背最长肌、皮下脂肪等8个组织的总RNA，按照反转试剂盒进行cDNA合成，miRNA定量所需cDNA的反应总体系20 μL：第一步反应为5 g DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，总RNA 2 μL，RNase Free ddH2O 5 μL， 42 ℃水浴2 min。第二步反应：上一步混合物 10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，miR-615茎环引物1 μL，5xPrimeScript Buffer 2 4 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。反应程序：50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；反应结束后，所得cDNA -20 ℃保存，备用。

1.3.4 miR-615组织表达分析根据miR-615成熟体序列，设计上、下游及茎环引物，以18S为内参基因，引物由上海生工生物工程有限公司合成，详细信息见表2。采用qRT-PCR法检测 miR-615在心、肝、脾、肺、肾、瘤胃、背最长肌、皮下脂肪等8个组织中的表达量。反应体系：2xChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Primer F 0.8 μL，Primer R 0.8 μL，cDNA模板2 μL，RNase Free ddH2O 6.4 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性10 s，56.5 ℃退火 30 s，共40个循环。每个样品做3个重复，以2-ΔΔCT法计算相对表达量，数据用SAS 8.2软件进行分析。

表2 miR-615定量引物信息Table 2 miR-615 quantitative primer information

2 结果与分析

2.1 miR-615序列保守性分析

从NCBI数据库中检索出牛miR-615的序列，并与人、猕猴、小鼠、马、猩猩、犬等11个物种的miR-615序列进行比对分析。结果表明(图1)，不同物种之间的保守序列存在着一定差异，但Motif 1 在所涉及的物种间是共同的保守区域(图1-A)，在对该区域进行功能富集分析发现(图1-B)，该保守区域细胞定位于nucleus，主要参与蛋白质结合及转录等过程。牛miR-615保守区域2和3也主要富集到转录过程，表明miR-615的主要功能是参与遗传物质的转录过程，这与miRNA集合到靶位点从而影响靶基因转录的功能相一致。

2.2 miR-615靶基因预测结果

利用TargetScan、miRWalk和miRDB软件分别预测到2 903、14 254和288个miR-615的靶基因，取三者的交集，获得108个共有靶基因，其中miRTarbase数据库中经试验验证的靶基因有35个，合并后共得到139个基因集合用于后续功能富集分析(图2，表3)。

表3 miR-615的靶基因统计Table 3 Statistics of miR-615 target genes

2.3 miR-615靶基因集合的GO分析

针对139个靶基因进行GO分析，结果发现共有29个GO条目，其中15个GO条目属于生物学过程(Biological process，BP)，靶基因富集程度最高的GO条目有RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录调控、基因表达的正调控及钙离子调节的神经递质胞吐等；4个GO条目分布在细胞组分(Cell components，CC)，其中在细胞内膜和细胞质富集的基因最多；10个GO条目为分子功能(Molecular function，MF)，靶基因显著富集在RNA聚合酶Ⅱ转录因子与DNA的特异性结合、GTP酶激活剂的活性、组蛋白去甲基酶活性(H3-K27特异性)等条目中(P<0.05)(表4)。

表4 miR-615潜在靶基因的GO注释Table 4 GO annotations of miR-615 predicted target genes

2.4 miR-615靶基因集合的KEGG分析

经KEGG富集通路分析，miR-615的靶基因显著富集于PI3K-AKT和MAPK信号通路 (P<0.05)(表5)，以上通路在肌肉生长发育、脂肪沉积、能量代谢过程中发挥重要的调控作用。其他富集通路尽管未达到显著性水平，但也多与肌肉发育及能量代谢等过程密切关联，如STIM1是定位于细胞内质网上的蛋白，它的主要功能是介导受体依赖型的钙离子内流，而钙离子作为第二信使能直接与Ras-GTP结合并显著增加Ras信号通路的活性[24]。研究发现STIM1的表达可促进成骨细胞的增殖，从而增加成骨细胞的数量，在MC3T3-E1细胞沉默STIM1的表达后，明显抑制钙离子依赖的Ras信号通路的活性 (P<0.05)，成骨细胞会出现增殖抑制现象[25]。

表5 miR-615潜在靶基因KEGG通路富集分析Table 5 KEGG pathway enrichment analysis of target gene predicted by miR-615

2.5 牛miR-615的组织表达鉴定

采用茎环荧光定量PCR方法检测牛各组织中miR-615的表达，由图3可知，miR-615在皮下脂肪中的表达量最高，其次是背最长肌；miR-615在背最长肌和心脏组织中的表达差异不显著 (P>0.05)，但在皮下脂肪中的表达量显著高于背最长肌和心脏组织(P<0.05)。在其他组织中miR-615均呈现低表达模式，且各组织间表达差异不显著(P>0.05)。上述结果提示，牛miR-615可能通过机体脂肪代谢及肌肉活动过程发挥重要生物学功能，但详细机制需进一步的试验进行佐证。

3 讨论

胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2，IGF2)是一种胎儿生长分化因子，在肌肉生长和成肌细胞增殖分化中起重要作用[26]，高表达IGF2时，可以促进肌肉的形成，而当IGF2基因被抑制时，则阻碍肌肉生成[27]。IGF2基因是miR-615的预测靶基因，大量研究证明IGF2基因在肌肉生长发育中起着极其重要的作用，它可以与肌肉发育相关的转录因子作用从而调控其过程[28]。牛IGF2基因定位于 29 号染色体，由 10 个外显子组成，该染色体包含牛的产肉、产奶和健康性状的数量性状位点[29-30]。研究发现秦川牛IGF2基因内含子3序列中 3 106 bp 位置附近的序列是转录因子ZBED6在牛基因组上的结合位点，干扰ZBED6后，对IGF2基因的表达具有明显抑制作用，从而阻碍了肌肉的生成；而过表达后则促进IGF2基因表达，并加快肌肉的生长发育[31]。本试验所得结果中IGF2是miR-615 的靶基因之一，牛 miR-615是否通过IGF2基因调控肌肉的生长发育目前仍不明确，IGF2 也将是后续开展试验验证的关键候选靶基因之一。

对 miR-615 靶基因集合进行 KEGG 富集分析，发现靶基因集显著富集于PI3K-AKT信号通路，该通路是细胞周期过程中非常重要的细胞内信号传导途径，其通过影响下游分子的活化状态维持细胞的凋亡和增殖[32]。PI3K是脂质激酶家族成员，通过磷脂酰肌醇(PI)的特异性催化3-羟基磷酸化[33]；AKT是丝氨酸/苏氨酸激酶，是PI3K途径的中心介质，在许多细胞过程中起关键作用，包括葡萄糖代谢，细胞凋亡、增殖和迁移[34]。苏氨酸磷酸化位点(Thr308)和丝氨酸磷酸化位点(Ser473)发生磷酸化后激活AKT蛋白，激活后的AKT直接磷酸化其底物雷帕霉素靶体蛋白(mTOR)，从而使其被激活。大量研究表明，PI3K-AKT-mTOR信号通路对骨骼肌的生长、存活和分化至关重要[35]。葡萄糖调节内质网伴侣蛋白94(GRP94)对早期胚胎发育至关重要，上调GRP94可使PI3K-AKT-mTOR信号通路中PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平降低，从而抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路，但可使C2C12细胞中转录因子MyoG的表达水平升高，表明GRP94可通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路而促进肌肉分化[36]。此外，MSCs是骨髓中存在的一类具有强大增殖能力和多向分化潜能的非造血干细胞，能定向分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等，在MSCs成骨诱导分化过程中，加入PI3K特异性抑制剂LY294002后，明显抑制AKT的磷酸化，从而抑制MSCs的生长，提示PI3K-AKT信号通路在MSCs成骨诱导分化中起正调节作用[37]。但miR-615是否通过靶向GRP94基因来调节PI3K-AKT-mTOR信号通路，并调控牛肌细胞的增殖分化有待进一步验证。

MAPK信号通路是本试验通过KEGG分析发现的靶基因显著富集的通路(P<0.05)，该通路由细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38-MAPK)3 个家族成员组成，这些通路是肌肉发育、脂肪生成的主要细胞内信号通路之一[38]，该通路可能受一些上游因素的影响，或者影响下游因素，或直接影响脂肪因子、脂肪细胞分化基因的表达[39]。参与MAPK信号传导的基因主要包括MAP3K5、MAP2K3和MAP2K2[40]。研究发现MAP3K5基因对畜禽RFI性状具有重要的调控作用，该基因不仅是生长及采食特征相关的候选基因，同时也与胚胎发育、肌肉发生、脂肪形成以及细胞免疫等密切关联[41]，当敲除或突变MAP3K5基因后，H2O2诱导的JNK活性受到抑制，进而抑制c-JNK N末端激酶和p38-MAPK激酶触发凋亡激酶级联反应，使得宿主细胞的分化凋亡、胃排空速率及食物利用效率显著下降[42]，即脂肪代谢效率下降，脂肪在机体内储存，最终导致人和家畜肥胖；而肌肉中脂肪的含量与肉的风味、嫩度和多汁性存在密切联系，因此MAPK信号通路(尤其MAP3K5基因)可能在牛肌肉生长发育过程中发挥重要作用。MSCs是一种自我更新和分化的干细胞，骨形态发生蛋白2(BMP-2)或骨形态发生蛋白4(BMP-4)诱导的MSCs具有显著的成骨倾向[43-44]，是骨折愈合过程中的关键细胞之一。有研究发现，负压伤口治疗(NPWT)通过MAPK途径促进MSCs的增殖和成骨分化，当ERK、P38和JNK通路受到抑制时，成骨细胞相关基因和蛋白的表达降低，细胞的增殖能力下降，从而NPWT受到抑制[45]；p38通路的抑制降低了BMP4诱导的MSCs的成骨能力，而在多能干细胞C2C12成肌细胞系中，BMP-2可激活ERK和p38[46]。过度运动会导致氧化应激引起肌肉的炎症反应，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)是一种抗炎分子，PPARγ通过抑制分化的C2C12细胞中ERK、p38-MAPK信号通路和核转录因子-κB(NF-κB)从胞浆向细胞核转运，显示出抗炎和抗氧化双重作用，从而保护肌肉纤维[47]。由此推测miR-615可能通过靶向MAPK通路中MAP3K5、PPARγ等基因影响肌肉发育。