欧芹根总黄酮对体外脂肪肝细胞模型脂联素及其受体表达的影响
2021-10-30刘飞，陈妍，姜林
刘 飞，陈 妍，姜 林
（1新疆医科大学附属中医医院药学部，乌鲁木齐 830000；2新疆医科大学第二附属医院药学部，乌鲁木齐 830061）
非酒精性脂肪肝（NAFLD）是临床常见疾病，主要包括肝脂肪变性以及脂肪异常积蓄，是无明显饮酒史及既往肝病史的临床代谢综合征[1-2]。患者发生NAFLD 后肝脏会逐步呈硬化状态，致使患者进一步发生肝硬化、肝癌等疾病，严重威胁患者生命安全[3]。目前，该病的发病率逐年上升，且患病人群趋于年轻化。目前NAFLD 防治主要利用药物进行干预，但他丁类调脂药可导致肝脏功能损害[4]。因此寻找副作用小、安全稳定的天然药物对NAFLD 的治疗具有临床意义。课题组前期发现欧芹根总黄酮能显著改善NAFLD 大鼠的病理学改变，且能提升脂联素水平[5-8]。脂联素(adiponectin，Adipo Q)是由脂肪组织分泌的一种细胞因子，也称为30kDa 的脂肪细胞补体相关 蛋 白、AdipoQ、apM1 或rGBP28[9]。脂联素水平改变预示着肝脏脂肪变性程度的变化，其水平的降低可形成促炎环境，在脂肪肝发展到NAFLD 炎，甚至肝纤维化的过程中起着重要作用[10]。为了探讨欧芹根总黄酮治疗NAFLD 的作用机制以及对脂联素及其受体的相关性，进行了本实验。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂L-02 人正常肝细胞购于北纳生物，细胞培养条件为DMEM(高糖)培养基+10%FBS+1%PS，37℃，5% CO2，饱和湿度。欧芹根总黄酮：欧芹根用70% 的乙醇回流提取2 次，每次1 h。提取液浓缩干燥为浸膏。蒸馏水溶解后上样（D101 型大孔树脂），依次用30%、50%、70%、90% 的乙醇洗脱，洗脱液浓缩干燥备用。欧芹根总黄酮储备液：用DMSO 配置为100 mg/mL 的母液，使用时稀释至所需浓度。游离脂肪酸（FFA）储备液：FFA 为油酸OA∶棕榈酸PA = 2∶1（OA∶PA = 2∶1）。CO2细胞培养箱：上海力康仪器有限公司Smart Cell HF-90；酶标仪：Bio-Rad公司xMarkTM；凝胶成像系统：上海天能2500；PCR仪：美国Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler；Real Time PCR instrument：美国ABI QuantStudio™6 Flex Real-Time PCR Syste。 胎 牛 血 清(FBS)（FND500，Excell Bio）；MEM（高糖）培养基（C11995599BT，GIBCO）；甘油三酯（TG）测定试剂盒（A110-1，南京建成）；总胆固醇（T-CHO）测定试剂盒（A111-1，南京建成）。
1.2 方法
1.2.1 细胞模型的建立 与干预浓度筛选 取汇合率达90% 的细胞，胰酶消化细胞后，制备成5×104个/mL单细胞悬液，接种至96 孔板中，37℃、5% CO2培养24 h 贴壁后，弃去培养基，分别加100 µL 不同浓度FFA溶液（0、0.5、1、1.5、2 mmol/L），5 个重复，干预后弃去培养基，加100 µL，10% CCK-8 溶液，在培养箱中继续孵育，1 h 后测定450 nm 处的OD 值。单细胞悬液，接种至24孔板中，4%的甲醛固定液500 µL固定细胞20 min；加油红O 染液,置倒显微镜下观察结果，观测细胞内脂滴形成。筛选FFA 无毒性干预浓度。同法加100 µL 不同浓度欧芹根总黄酮溶液（0、5、10、25、50、100、200 µg/mL）干预24 h，5 个重复，1 h 后测定450 nm处的OD值。筛选出的3个干预浓度与FFA共同干预24 h，收集上清，按MDA 试剂盒进行检测；收集1×106个细胞，加入0.2 mLPBS 重悬细胞，破碎细胞，放入液氮中5～8 s/次，间隔30 s，制备好的匀浆液不离心，按TG和TC试剂盒进行检测。
1.2.2 欧芹根总黄酮对细胞模型脂联素的影响 按实验分组干预细胞，空白对照组：L-02 细胞正常培养24 h；NAFLD 模型组：L-02 细胞FFA 干预24 h；药物治疗组：L-02 细胞欧芹根总黄酮+FFA 干预24 h。收集上清，按MDA 试剂盒说明书进行检测；同时收集1×106细胞，加入0. 2 mLPBS重悬细胞，采用反复冻融破碎细胞，放入液氮中5～8 s/次，间隔30 s，制备好的匀浆液不离心按TG、TC 试剂盒说明书进行检测，同时测定蛋白浓度。弃去每组细胞瓶中的培养基，加入1 mL Trizol消化细胞，使Trizol平铺在细胞层面上，反复摇晃细胞培养瓶，装入1.5 mL EP 管中。后续实验进行qRT-PCR 实验操作，引物信息及PCR 程序详见表1、2。按实验分组干预细胞，每组3个重复，操作方法同细胞传代。离心后弃去上清留细胞沉淀，用5 mL 无菌PBS 洗后收集细胞。后续实验按照Western Blot 实验操作进行，检测细胞中ADPN、ADIPOR-2 蛋白表达。
表1 荧光定量检测引物信息表
1.3 统计学分析运用SPSS22.0软件对数据进行统计学分析，采用单因素方差分析方法统计，所有数据采用均值±标准差（±s）表示，以P<0.05 表示差异有统计学意义。
表2 荧光定量PCR程序
2 结果
2.1 FFA 浓度与干预浓度筛选结果细胞增殖检测及油红染色结果显示FFA 浓度高于1 mmol/L 时细胞出现毒性反应，故选择1 mmol/L 进行NADLD 模型建立。CCK8 检测结果显示，5～100 µg/mL 浓度对细胞均无毒性，选择欧芹根总黄酮浓度为10、25 以及50µg/mL测定生化指标，结果显示50 µg/mL浓度的欧芹根能明显降低TG、TC、MDA 水平(P<0.05），结合油红O 染色细胞内脂滴形成情况选择50 µg/mL 欧芹根浓度进行干预，见表3、图1。
表3 不同浓度欧芹根总黄酮+FFA干预对L-02细胞生化指标的作用结果（±s，n=40）
表3 不同浓度欧芹根总黄酮+FFA干预对L-02细胞生化指标的作用结果（±s，n=40）
注：与0µg/mL+FFA 1 mmol/L 比较，▲P<0.01；与10 µg/mL+FFA 1 mmol/L 比较，△P<0.05；与25 µg/mL+FFA 1 mmol/L比较，▼P<0.05
欧芹根总黄酮/（µg/mL）FFA 1 mmol/L 0 10 25 50 TG/（mmol/gprot）0.210±0.032 0.203±0.011 0.186±0.019 0.124±0.018▲△▼TC/（mmol/gprot）0.384±0.047 0.378±0.018 0.340±0.044 0.269±0.031▲△▼MDA/ (nmol/mL)2.976±0.649 2.829±0.729 2.634±0.401 1.293±0.372▲△▼
图1 油红O染色图片
2.2 欧芹根总黄酮对细胞模型的影响实验结果显示与空白组相比，ADPN、ADIPOR-2 在NAFLD 模型组中表达显著降低；与NAFLD 模型组相比，ADPN、ADIPOR-2在药物治疗组中表达显著升高，见表4。
表4 欧芹根总黄酮对NAFLD细胞模型生化指标的作用结果（±s，n=30）
表4 欧芹根总黄酮对NAFLD细胞模型生化指标的作用结果（±s，n=30）
注：与空白对照组比较，△P<0.05；与NAFLD 模型组比较，▲P<0.05
分组空白对照组NAFLD模型组药物治疗组TG/（mmol/gprot）0.069±0.010 0.234±0.053△0.159±0.032△▲TG/（mmol/gprot）0.104±0.041 0.320±0.084△0.222±0.031△MDA/ (nmol/mL)1.377±0.385 3.091±0.372△1.792±0.142▲
2.3 qRT-PCR 与WB 检测结果与空白组相比，ADPN、ADIPOR-2 在NAFLD 模型组中表达显著降低，提示造模成功。与NAFLD 模型组相比，ADPN、ADIPOR-2 在药物治疗组中表达显著升高，且差异有统计学意义（P<0.05），见表5、6。
表5 qRT-PCR检测结果（±s，n=15）
表5 qRT-PCR检测结果（±s，n=15）
注：与空白组相比，△P<0.05;与NAFLD模型组相比，▲P<0.05
分组空白组NAFLD模型组药物治疗组ADIPOR-2 1.006±0.393 0.303±0.162△0.639±0.184▲ADPN 1.019±0.223 0.362±0.161△0.893±0.145▲
表6 WB检测结果（±s，n=15）
表6 WB检测结果（±s，n=15）
注：与空白组相比，△P<0.05;与NAFLD模型组相比，▲P<0.05
分组空白组NAFLD模型组药物治疗组ADIPOR-2 0.408±0.032 0.216±0.034△0.443±0.045▲ADPN 0.438±0.168 0.230±0.017△0.441±0.026▲
3 结论
NAFLD 的发病机制至今尚未完全阐明。但脂质代谢紊乱，进而引起肝细胞脂肪变性是NAFLD 的主要特点。本研究结果显示，与模型组相比，欧芹根药物治疗组的TC、MDA水平显著低于模型组，且差异有统计学意义（P<0.05），TG 水平也有所降低，但差异无统计学意义。病理切片也表示药物组肝细胞变性程度显著减轻。提示欧芹根总黄酮对NAFLD 有显著的治疗作用。本研究找到了欧芹根总黄酮的最佳细胞干预浓度，且发现治疗作用会随着药物浓度的升高而增高，提示该药物的治疗作用存在一定的剂量依赖性。
脂联素是脂肪细胞分泌的一种特异性蛋白，以多种形式存在于血浆中，主要通过与脂联素受体1(adiponectin receptor 1，Adipo R1) 和脂联素受体2(ad⁃iponectin receptor 2，Adipo R2)2 种受体结合来发挥多种生物学作用，可以通过循环系统以及旁分泌和自分泌等多种渠道对机体肝脏、骨骼肌和脂肪组织等脂代谢靶组织产生作用，进而达到调控机体脂代谢与维持其平衡的目的[11]。相关研究认为，脂联素在NAFLD 的发生、发展中起重要作用[12-15]。本研究经qRT-PCR 与WB 检测结果显示，与空白组相比，ADPN、ADIPOR-2 在NAFLD 模型组中表达显著降低，提示造模成功。与NAFLD 模型组相比，ADPN、ADIPOR-2 在药物治疗组中表达显著升高，且差异有统计学意义（P<0.05）。实验显示欧芹根总黄酮能够明显提升脂肪肝细胞的脂联素水平和其2 型受体的表达。提示该药的作用机制可能与激活脂联素及其相应受体相关。
