基于网络药理学和分子对接探索桂枝茯苓丸治疗卵巢癌的作用机制

吴晓晴，卢雯平

（中国中医科学院广安门医院，北京 100053）

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，中国人群卵巢癌新发病例为52 971 例/年，死亡达30 886 例/年［1］。中医认为卵巢癌属于“癥瘕”、“积聚”等范畴，治疗宜温阳益气，活血消癥。桂枝茯苓丸首载于《金匮要略》，具有活血化瘀消癥之效，仲景用其治疗妇科癥瘕、胎动不安、胎漏，后人用其治疗卵巢癌、月经病、子宫肌瘤、卵巢囊肿、子宫内膜异位症、肿大增生性内科疾病、心脑血管疾病等［2］也取得了良好的临床效果。有动物体外和体内实验报道了桂枝茯苓丸能诱导卵巢癌细胞凋亡［3］，抑制大鼠和裸鼠移植瘤的生长［4，5］，联合西医治疗能加强晚期卵巢癌患者的疗效，提高生存质量［6，7］。中药复方治疗疾病具有多成分、多靶点的特点，因此本文采取网络药理学的研究方法，预测桂枝茯苓丸作用卵巢癌的治疗靶点和信号通路，并使用分子对接进行验证。

1 资料与方法

1.1 筛选桂枝茯苓丸的有效成分和靶点

在TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）数据库中分别检索桂枝、茯苓、赤芍、牡丹皮和桃仁，得到每味中药的化学成分。根据口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18 的属性值对检索到的所有化学成分进行筛选，收集到桂枝茯苓丸的活性成分。通过TCMSP 数据库查找收集到的活性成分的作用靶点，根据已发表的文献对药物靶点进行补充。在Uniprot 数据库中，将已知药物靶点蛋白转化为靶基因。使用Cytoscape 软件构建桂枝茯苓丸药物-成分-靶基因网络图，使用Network Analyze 功能对该网络进行拓扑分析，得到该网络各个节点的度值Degree 值、紧密度Closeness 值和介度Betweenness值三个参数的值确定药物的主要活性成分。

1.2 筛选卵巢癌的疾病靶点

在Genecards 数据库中检索关键词“ovarian cancer”、“ovarian carcinoma”，获取疾病靶点。Score值的大小代表该靶点与疾病的相关度，选取Score值大于中位数的靶点作为卵巢癌的疾病靶点。在OMIM、Digsee、TTD、Drugbank 数据库中检索上述关键词，把获取的疾病靶点补充到在Genecards 数据库中得到的靶点中，在Excel 表中进行去重，得到最终的疾病靶点库。使用Uniprot 数据库将最终得到的基因靶点转化为靶基因。

1.3 获取桂枝茯苓丸对卵巢癌的作用枢纽基因

枢纽基因是指是在生物学过程中发挥至关重要作用的基因，在相关通路中，其他基因的调控往往要受到该基因的影响，是重要的靶基因。使用R 3.5.3 软件对桂枝茯苓丸作用靶基因和卵巢癌的疾病靶基因取交集，并绘制韦恩图。使用String 网络进行蛋白质互相作用网络构建，蛋白质来源为“Homo Sapiens”，导出蛋白质互作网络的数据表，导入Cytoscape 中使用Cytohubba 插件筛选枢纽基因。将经过12 种算法计算出的枢纽基因取交集，筛选出前20 个权重较大的基因作为关键枢纽基因。

1.4 KEGG 通路富集分析和GO 富集分析

在Metascape 数据库中录入获取的20 个枢纽基因，来源选择“H.Sapiens”，进行自定义富集分析。设置筛选条件为：Min overlap＝3，Pvalue cutoff＝0.01，min enrichment＝1.15。分别进行KEGG 通路富集分析、GO 分子生物学功能（GO MF）、GO 生物过程（GO BP）、GO 细胞组分（GO CC）富集分析，并使用R 软件。

1.5 分子对接验证

在PubMed、中国知网、万方数据库中检索枢纽基因对卵巢癌作用的相关文献，筛选出研究较充分的靶点作为对接的靶蛋白。采用AutoDock Tools 1.5.6 软件去除靶蛋白中水分子，添加非极性氢，分离配体和受体，计算电荷，保存为pdbqt 格式文件。在PubChem 有机小分子生物活性（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载小分子3D 坐标文件，在pyMol 软件中利用openbabel 转换为pdb 格式，并下载主要活性成分的3D 结构文件，用Chem3D 17.1 软件转化为PDB 格式。将结构文件载入AutoDock Tools 1.5.6 软件，添加原子电荷，分配原子类型，所有柔性键均默认可旋转，作为对接配体。以靶蛋白作为受体，以药物主要活性成分作为配体，根据靶蛋白复合物中配体的坐标确定分子对接的活性位点，根据靶蛋白活性口袋设置Gridbox 坐标及大小，采用AutoDock Vina 进行分子对接，选取自由结合能最低的结合构象，使用PyMol和LigPlus 软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 桂枝茯苓丸活性成分及靶点

桂枝的活性成分有7个，茯苓的活性成分有15个，赤芍的活性成分有28个，桃仁的活性成分有23个，牡丹皮的活性成分有10个，其中谷甾醇、儿茶素为桂枝、牡丹皮、赤芍的共有成分，常春藤皂苷元为茯苓和桃仁的共有成分，β-谷甾醇为桂枝、赤芍和桃仁的共有成分，见表1。在数据库中筛选五味中药的作用靶点并去重后共得到201 个药物靶点，并对已知作用靶点的化合物根据中药名首字母进行编号（如桂枝中已知作用靶点的活性成分命名为GZ1、GZ2……）。不同中药共有的活性成分根据所共有的中药名首字母进行编号，如桂枝、赤芍和桃仁共有的活性成分命名为GCT，桂枝、牡丹皮和赤芍共有的活性成分命名为GMC1、GMC2，茯苓和桃仁共有的活性成分命名为FT。

表1 桂枝茯苓丸药物活性成分Tab 1 Active components of Guizhi Fuling pills

2.2 构建药物-成分-靶点网络图

使用Cytoscape 构建网络图，直观显示五味中药成分和靶点的关系及其重要性。图中共有252 个节点，633 条网络，节点的大小与度值相关，节点越大代表度值越大，见图1。度值是指连接该节点的边的数量，连接该点的边越多，度值越大，说明与该点相关的网络越复杂。根据拓扑分析结果获取药物的主要活性成分，见表2。

表2 桂枝茯苓丸主要活性成分Tab 2 main active components of Guizhi Fuling pills

图1 药物-成分-靶点网络图Fig 1 Drug-ingredient-target network diagram

2.3 桂枝茯苓丸对卵巢癌的作用靶点

在GeneCards 数据库中检索到卵巢癌的基因靶点7 071 个，筛选出相关度得分大于中位数的靶点作为疾病的潜在靶点，得到潜在靶点3 540 个。根据OMIM、TTD，DRUGBANK 数据库补充卵巢癌相关靶点，共得到疾病潜在靶点3 937 个。使用R软件将药物成分靶点和疾病靶点进行分析，得到共同靶点160 个，如图2。

图2 疾病靶基因-药物靶基因韦恩图Fig 2 Wayne map of disease target gene-drug target gene

2.4 桂枝茯苓丸治疗卵巢癌的枢纽基因

把药物和疾病的交集基因靶点导入String 数据库，限定物种为人，获取蛋白质相互作用网络图，共有160 个节点，618 条边，平均节点度值7.72。将经String 数据库分析后的数据导入Cytoscape 软件后，使用Cytohubba 插件进行拓扑分析，得到了各个节点的关键程度，构建了蛋白质互作网络图，节点的颜色越深代表节点在网络中的权重越大，即在网络中发挥的作用越关键，见图3，根据12 种算法计算出的枢纽基因取交集得到值最大的20 个枢纽基因，分别为VEGFA、AKT1、MAPK8、JUN、MMP9、IL-6、TNF、CXCL8、PTGS2、TP53、CASP3、MAPK1、EGF、ESR1、EGFR、MYC、FOS、CCL2、CXCL8 和IL1B，这些节点最有可能是药物在治疗疾病中发挥作用的关键节点。

图3 蛋白质相互作用网络图Fig 3 Protein-protein interaction network

2.5 KEGG 通路富集分析和GO 富集分析

将枢纽基因进行KEGG 通路富集分析和GO 富集分析，获得靶基因参与的通路和生物过程。KEGG 通 路160 个条目，GO MF 分析245 条目，GO BP 分 析3 083 个 条 目，GO CC 分 析205 个 条 目。

根据-log10（P）值筛选出10 条较为主要的通路，为癌症信号通路、MAPK 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、美国锥虫病、糖尿病并发症中的年龄-年龄信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、百日咳、IL-17 信号通路、膀胱癌，如图4 所示。IL-17 信号通路富集基因数和富集程度最高，癌症信号通路的富集基因数量和富集程度均较高，肿瘤坏死因子信号通路富集程度较高，这3 条通路可能是桂枝茯苓丸治疗卵巢癌的靶标通路。

图4 KEGG 通路富集分析结果图Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis result diagram

在Metascape 中对药物和疾病的枢纽基因靶点进行GO MF、GO CC、GO BP 三个部分的富集分析，P 值越小代表富集程度越高，筛选出每个部分富集程度最高的10 个结果，使用R 软件进行可视化，绘出气泡图，气泡的大小代表富集基因的数量，气泡的颜色代表富集程度，红色代表富集程度高，绿色代表富集程度低，见图5～7。由此得出，在分子生物学功能中，主要参与细胞因子受体结合、细胞因子活性、一氧化氮合酶调节活性、受体配体活性、受体调节活性、生长因子受体结合、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子结合、核心启动子结合、转录因子结合、磷酸酶结合这些功能过程，见图5；在细胞组分富集分析中，含有膜筏、膜微区、膜内区、质膜筏、囊腔、RNA 聚合酶Ⅱ转录因子复合物、分泌颗粒腔、细胞质囊腔、转录因子复合物、受体复合体10 个条目，见图6；在生物过程中，药物主要参与对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、氧化应激反应、对活性氧的反应、镉离子对细胞的反应、细胞迁移的正调控、细胞因子介导的信号通路、细胞运动的正向调节、细胞成分运动的正向调节、运动正调节这些过程，见图7。

图5 GO MF 分析结果top10Fig 5 Top10 of GO MF analysis result

图6 GO CC 分析结果top10Fig 6 Top10 of GO CC analysis result

图7 GO BP 分析结果top10Fig 7 Top10 of GO BP analysis result

2.6 分子对接结果

槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、常春藤皂苷元、儿茶素、鞣花酸、豆甾醇和花旗松素分别与选取的IL-6、MAPK1、VEGFA、AKT1、TP53、TNF 和CCL2 编码的蛋白作为靶点进行小分子-蛋白分子对接。结合自由能可以评估受体和配体之间的亲和性，结合能小于0 时，认为配体和受体可以自由结合［8］，且结合自由能越低，二者亲和力越强，对接结果如表3。鞣花酸和TNF-α 蛋白亲和力最强，将这一构象进行 可视化分析，结果见图8。

图8 TNF-α 蛋白和鞣花酸的分子对接构象图Fig 8 Molecular docking conformation of TNF-α protein with ellagic acid

表3 靶蛋白和药物主要活性成分分子对接结合自由能表（kcal/mol）Tab 3 Free energy table of docking binding between target proteins and main active components of drugs（kcal/mol）

3 讨论

卵巢癌属于中医妇科癥瘕范畴内，瘀血凝聚是卵巢癌形成的原因之一，桂枝茯苓丸具有活血化瘀消癥的功效，在《金匮要略》中提到：“妇人宿有癥病，经断未及三月，而得漏下不止，胎动在脐上者，为癥痼害……当下其癥，桂枝茯苓丸主之”，可见仲景用此方治疗妇科癥瘕。方中桂枝为君药，温通经脉，调和营卫；茯苓利水渗湿，“血不利则为水”，既能化瘀利水，又能给瘀血以出路；桃仁能活血祛瘀，且有“苦以泄滞血，甘以生新血”一说，能祛瘀血而生新血；牡丹皮清热凉血，活血化瘀；赤芍入血分，能清热凉血，散瘀止痛。全方以攻邪为主，处方精妙，共奏活血化瘀，散结消癥之效。

根据拓扑分析找到了桂枝茯苓丸的主要活性成分，分别为槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、常春藤皂苷元、儿茶素、鞣花酸、豆甾醇、花旗松素。既往研究发现槲皮素能上调TP53 基因，促进癌细胞的凋亡［9］，还能抑制PTK、PKC、MAPK 等多条信号通路［10，11］，抑制癌细胞周期进程，能逆转癌细胞的耐药性，增加癌细胞对药物的敏感性［12］。β-谷甾醇能抑制癌细胞增殖并促进其凋亡［13］，抑制肿瘤细胞对基底膜的黏附和侵入而阻止癌细胞转移［14］，且具有预防肿瘤和治疗肿瘤的双重作用［15］。山奈酚是黄酮类化合物，能够抑制细胞生长，诱导细胞凋亡［16］，通过激活p53 的内在途径诱导卵巢癌细胞凋亡［17］，还能与雌激素受体结合产生抗肿瘤作用［18］。常春藤皂苷元能抑制卵巢癌瘤体的生长［19］，具有对肿瘤细胞的膜分解活性，诱导肿瘤细胞凋亡［20］。儿茶素包括表儿茶素、表没食子儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯，研究发现儿茶素能增加卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性［21］，损伤DNA 和减少DNA 合成抑制癌细胞增殖［22］，下调血管内皮生长因子，减少MMP2 和MMP9 的分泌［23］。鞣花酸可抑制致癌物质在体内的代谢，与致癌物结合，使其不能与DNA 结合致癌，或直接与DNA 结合，竞争性抑制致癌物与DNA 结合，消除致癌剂毒性，降低癌细胞抗药性，降低癌细胞中ATP 水平，阻断细胞生殖周期［24］。豆甾醇衍生物能抑制卵巢癌细 胞 的 增 殖［25，26］。花 旗 松 素 抑 制 热 休 克 蛋 白90 抑制癌细胞增殖［27］，对胃癌、肝癌、宫颈癌和盲肠癌有生长抑制作用［28］，干预影响肿瘤细胞增殖的Wnt/β-catenin 通路［29］，阻滞细胞周期，诱导肿瘤细胞的凋亡与P53/P21 途径有关［30］。

根据核心靶点、KEGG 通路分析和已有研究，提示桂枝茯苓丸治疗卵巢癌主要调节了肿瘤信号通路、MAPK 信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、IL-17 信号通路。癌症信号通路包括MAPK信号通路、Wnt 信号通路、PI3k-Akt 信号通路、Jak-STAT 信号通路、钙信号通路、PPAR 信号通路、雌激素信号通路、p53 信号通路、VEGF 信号通路等多条通路。IL-17 家族与受体结合后，可诱导IL-6 活化下游的信号通路，促进癌细胞增殖。局部高浓度的TNF-α 可以杀伤肿瘤细胞，但是缓慢释放的TNF-α 可以激发血管生成因子和趋化因子等细胞因子，促进卵巢癌细胞的种植转移和新生血管生成［31］，可 介 导NF-κB 信 号 通 路，抑 制 细 胞 凋 亡，MYC 是该通路的下游基因。有临床试验观察到33%的复发性卵巢癌患者使用TNF 抑制剂依那西普治疗后肿瘤稳定期延长了22～40 周，降低了血清内的IL-6 和CCL2［32］。MAPK1、MAPK8 属于丝/苏氨酸蛋白激酶，其亚族包括主要包括细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和细胞外信号 调 节 激 酶5［33］，MAPK1 参 与ERK1/2 信 号 通 路，MAPK8 参与JNK/SAPK 通路，雌激素与雌激素受体α 结合后可通过刺激血清效应元件激活ERK1/2信号通路，促进癌细胞增殖，ERK1/2 和JNK 通路的持续激活可增加癌细胞对铂类药物的耐药性，参与多种细胞因子对癌细胞的增殖、凋亡、转移作用［34］。VEGFA 是血管内皮生长因子的一种，主要参与调控血管生成，VEGFA 间接激活PI3K［35］，PI3K 参与内皮细胞微管的形成，也参与内皮细胞增殖、存活、迁移和血管通透性的形成［36］。AKT1 是PI3K 信号通路下游的主要受体［37］，激活AKT1，合成并释放基质金属蛋白酶使肿瘤血管通透性增加，血管扩张，内皮细胞迁移。MMP9 是基质金属蛋白酶的一种，属于明胶酶类，其能释放生长因子促进肿瘤生长，可降解细胞外基质帮助脱落的癌细胞在体内转移［38］。IL6、CXCL8 和IL1B 是免疫调节细胞因子，卵巢癌患者血清和腹水内存在高表达的IL6，与不良预后相关［39］，可导致对铂类的耐药性［40］，能间接激活PI3K/AkT 和P38MAPK 通路刺激癌细胞增殖［41］［42］［43］。JUN 是一种原癌基因，转录翻译为c-jun蛋白，与FOS 转录翻译的c-fos 蛋白形成的二聚体是转录因子AP-1 的组成部分，在体内的表达量与癌细胞的分化程度成正相关［44］，可通过ERK1/2 被激活促进基因的转录和表达［45］。PTGS2、MYC 属于癌基因，PTGS2 和MYC 的产物PTGS2 蛋白和myc 蛋白能抑制细胞凋亡，抑制免疫监视，促进细胞增 殖，促 进 血 管 生 成［46，47］。CCL2 参 与JAK2-Stat5和p38MAPK 通路，增加血管内皮细胞的通透性，促进癌细胞转移［48］。TP53 是一种抑癌基因，TP53 基因突变为高级别子宫内膜样腺癌主要的分子生物学 特 点［49］，是 卵 巢 癌 复 发 的 独 立 危 险 因 素［50］。CASP3 是细胞内调节通路的下游效应分子，被激活的CASP3 是最终导致癌细胞凋亡的胱冬肽酶［51］。EGF 是一种细胞生长因子，EGFR 为其受体，EGFR与配体EGF 结合并激活后，激活下游的MAPK 信号通路、PI3K/AKT 信号通路和JAK/STAT 通路，共同促进癌细胞增殖和转移［52，53］。ESR1 是雌激素受体（ER）α 的编码基因，雌激素能促进ER 阳性的卵巢癌myc 蛋白表达增加，进而促进卵巢癌细胞增殖［54］。EGF 可通过激活MAPK 通路加强ERα 的促转录效应［55］，ERα 与雌激素结合后与靶基因上的雌激素受体反应元件结合调控基因的转录［56-57］。在GO 分析中，主要活性成分的生物功能、细胞组分和生物过程均涉及多种细胞分子和机体对细胞分子的反应过程，药物的分子生物学功能主要为调控配体受体的结合、调控细胞因子和受体的活性、底物的去磷酸化和调节基因的转录过程，细胞组分主要与细胞膜有关，在生物学过程方面主要影响细胞的迁移、由细胞因子介导的信号通路、外界致癌物致病和炎症反应。综上所述，桂枝茯苓丸治疗卵巢癌可能主要通过调节多种细胞因子调控免疫系统、抑制血管内皮细胞增殖，进而抑制癌细胞增殖和转移。

分别把桂枝茯苓丸主要活性成分和核心靶点进行分子对接，结果显示结合自由能均低于0，即主要活性成分和核心靶点之间可以进行自由结合。在鞣花酸-TNF-α 分子对接构象图中可以看出，配体羟基可与GLU116、CYS101 形成氢键作用，形成的氢键键长分别为2.92、3.31。疏水残基Pro100、Gln102、Glu104、Cys101、Ser99、Glu116、Lys98 形成的堆积作用有助于配体的结合。

恶性肿瘤的发生发展涉及多靶点、多环节，人们在使用现有靶向药物治疗的过程中逐渐发现了单靶点药物的缺点，因此开始寻求多靶点药物治疗恶性肿瘤。基于网络药理学对桂枝茯苓丸治疗卵巢癌的机制探讨，充分体现了桂枝茯苓丸治疗卵巢癌多组分、多靶点、多通路的治疗特点，为今后进一步的研究提供了参考意义。