二甲双胍对糖尿病模型大鼠血糖控制及肾脏的保护作用

宋和勇 王红练 王淼舟 王亚峰 杨卉 朱奎德

(1青海省第五人民医院临床药学科，青海 西宁 810006；青海大学附属医院 2检验科；3肿瘤内科；4青海省人民医院药学部；5青海大学附属医院临床药学科)

糖尿病(DM)现已成为危害人类健康的重要疾病之一，中国DM患者发病率约9.5%〔1〕。DM肾病(DN)是一种发病隐匿的DM微血管并发症，发病早期患者常无自觉症状，一旦出现实验室检查异常及临床症状，已进入DN晚期或终末期肾衰竭。而目前晚期DN的治疗手段有限，以透析为主，透析后治疗效果不佳，且患者生存期较短〔2〕。DN发病机制对于疾病的预测及预后及开发有效的治疗方式相当重要。然而DN的发病机制较为复杂，目前主要认为在高血糖状态下，信号转导通路发生紊乱导致胰岛素抵抗、炎性介质的释放现象发生及肾脏血流的改变。DN病理改变包括：肾小球基底膜逐渐增厚、系膜基质逐渐增生、K-W结节逐渐形成、血管玻璃样变从而导致肾间质纤维。研究显示DM状态下，转化生长因子(TGF)-β1和重组结缔组织生长因子(CTGF)等肾组织纤维化相关因子参与纤维化的病理过程〔3,4〕。TGF-β1有多种生理功能，在肾脏纤维化中起重要角色〔5〕。在TGF-β1发挥促进肾脏纤维化的下游因子中，由半胱氨酸构成的CTGF也参与调节成纤维细胞生长的过程〔6〕。研究表明TGF-β1和CTGF二者均参与心肌纤维化过程，且协同促进心肌细胞纤维化作用〔7〕。二甲双胍可通过减轻体内的氧化应激、内质网应激、自噬等降低血糖，并有一定抑制组织纤维化的作用，从而发挥对肾脏保护作用〔8,9〕。本研究旨在探究二甲双胍对DM大鼠血糖的控制作用及对肾组织中TGF-β1和CTGF表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 34只健康雄性(SD)大鼠，8周龄，体重：180～220 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供〔合格证号码：SCXK(沪)2008-0016〕。所有SD大鼠在室温22～24℃，相对湿度45%～55%，12 h昼夜循环的动物房中进行饲养。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma-Aldrich公司。二甲双胍(国药准字H20023370，规格0.5 g/片)购自中美上海施贵宝制药有限公司、格列本脲(国药准字H44021808，规格2.5 mg/片)购自广东三才石歧制药有限公司。尿肌酐(Ucr)检测试剂盒(尿酶法)、尿素氮(BUN)试剂盒(苦味酸比色法)购自南京建成科技公司。尿微量白蛋白(UAlb)放射免疫试剂盒(RIA法)购自天津市协和公司。CTGF及TGF-β1酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。ABI7500型扩增仪，DS-5型糖化血红蛋白(HbA1c)检测仪。

1.2实验方法

1.2.12型DM(T2DM)大鼠模型的建立及分组 34只SD大鼠适应性喂养1 w后，将大鼠随机分为正常(Con)组(n=8)和DM组、二甲双胍组、格列本脲组共26只。正常组给予正常饲料喂养，其余26只大鼠给予高脂饲料喂养(高脂饲料：15%猪油、5%芝麻油、20%蔗糖、2.5%胆固醇和57.5%正常饲料混合而成)。饲养6 w，喂养高脂饲料大鼠体重达到300 g左右时，禁食不禁水12 h后腹腔注射35 mg/kg STZ柠檬酸钠缓冲溶液(0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH4.5)进行DM造模。Con组腹腔注射等剂量的柠檬酸钠缓冲溶液。7 d后，各组大鼠在乙醚麻醉状态下从眼底静脉取血测定空腹血糖(FPG)，取FPG>11.1 mmol/L的大鼠作为T2DM造模成功大鼠，共计24只。造模成功大鼠随机分为3组：DM组、二甲双胍组、格列本脲组，各8只。DM组每天灌胃生理盐水，二甲双胍组每天灌胃300 mg/(kg·d)的二甲双胍，格列本脲组每天灌胃5 mg/(kg·d)格列本脲，继续给予高脂饲养。

1.2.2生化指标测定及尿TGF-β1和CTGF含量的测定 DM组灌胃给药8 w后，各组禁食24 h，将各组放置于代谢笼中，收集大鼠12 h随机尿液，混匀后取5 ml在3 000 r/min条件下离心10 min，取上清，利用试剂盒检测尿TGF-β1和CTGF含量；各组在10%水合氯醛麻醉下抽取腹主动脉血，利用试剂盒检测HbA1c、Ucr、BUN、UAlb；计算尿TGF-β1与Ucr比值UTCR，CTGF与Ucr比值UCTR，UAlb与Ucr比值UACR用于表示尿液中TGF-β1、CTGF和UAlb的含量；取出肾组织，用生理盐水反复冲洗去除肾包膜后，将左肾部分组织置于液氮罐里用于聚合酶链反应(PCR)检测，余肾标本用于苏木素-伊红(HE)染色及Western印迹检测。

1.2.3RT-PCR检测肾组织中TGF-β1和CTGF mRNA表达水平 剪取各组一定量肾组织，于Trizol下研磨提取肾组织中RNA，利用逆转录试剂盒中反转录酶来进行体外互补DNA(cDNA)合成过程。以合成的cDNA为模板，按如下反应条件进行扩增：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸1 min热循环40次；95℃ 15 s、60℃ 1 min 及95℃ 15 s，循环1次。采用△△Ct法分析Ct值，以2-△△Ct来计算目的基因与参比基因(β-actin)。目的基因及参比基因的引物如下：CTGF引物：上游：5′-TCAACCTCAGACACTGGTTTCG-3′，下游：5′-TAG-AGCAGGTCTGTCTGCAAGC-3′;TGF-β1引物：上游：5′-GTCTCCCAAGGAAAGGTAGG-3′，下游：5′-CTCTTGAGTCCCTCGCATCC-3′;β-actin引物：上游：5′-TGAGAAACGGCTACCACATCC-3′，下游：5′-GCACCAGACTTGCCCTCCA-3′。

1.2.4Western印迹检测 各组取约200 mg肾组织，4℃下剪碎，加入1 ml 含PMSF的RIPA 裂解液进行匀浆，裂解30 min后，4℃下12 000 r/min离心30 min后取上清进行蛋白定量并根据蛋白量统一每个样本浓度为4 μg/ml。选择10%分离胶和5%浓缩胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样品。电泳完毕后湿法将蛋白质转移PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入兔抗鼠TGF-β1一抗(1∶1 000)、CTGF一抗(1∶1 000)、β-actin一抗(1∶2 500)，4℃孵育过夜，TBST 洗膜3次后放入辣根过氧化酶标记的抗兔二抗(1∶5 000)中，室孵育2 h，TBST洗膜3次后上机显影，由Image J 软件进行结果分析。

1.2.5HE染色 将大鼠肾组织石蜡包埋后。将切片依次放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡20 min，随后放入无水乙醇Ⅰ中5 min、无水乙醇Ⅱ中5 min；于75%乙醇中浸泡5 min，最后用超纯水清洗；苏木素染色5 min后超纯水洗、返蓝分色后梯度乙醇浸泡，伊红染色5 s；脱水封片后利用显微镜观察大鼠肾组织病理结果。

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1各组生化指标水平比较 与Con组比较，其余3组FPG、HbA1c、BUN、UTCR、UCTR、UCTR、UACR水平均显著升高(均P<0.05)；与DM组比较，二甲双胍组和格列本脲组FPG、HbA1c、BUN、UTCR、UCTR、UACR水平均显著降低(均P<0.05)；与格列本脲组比较，二甲双胍组BUN水平显著增加(P<0.05)，但UTCR、UCTR、UACR水平显著减少(P<0.05)。见表1。

表1 各组生化指标水平比较

2.2各组肾组织中TGF-β1和CTGF mRNA和蛋白表达水平比较 与Con组相比，其余3组TGF-β1和CTGF mRNA、蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与DM组相比，二甲双胍组和格列本脲组TGF-β1和CTGF mRNA、蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)；与格列本脲组相比，二甲双胍组TGF-β1和CTGF mRNA、蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图1,表2。

1～4：Con组，DM组，二甲双胍组，格列本脲组图1 Western印迹检测各组CTGF和TGF-β1表达

表2 各组TGF-β1和CTGF mRNA和蛋白表达水平比较

2.3各组肾脏病理变化 与Con组相比，其余3组肾小球体积增大、基底膜增厚、系膜基质增多，肾小球致密斑出现。见图2。对比DM组，二甲双胍组及格列本脲组肾小球基底膜变薄、系膜基质减少、肾小球致密斑减少，呈明显改善，二甲双胍组改善最为明显。

图2 各组肾脏组织形态(HE，×200)

3 讨 论

二甲双胍是T2DM的一线治疗药物，可通过对AMP激活蛋白酶(AMPK)信号转导系统，抑制肝脏糖异生、脂质合成，从而促进肌肉对葡萄糖的利用，另一方面通过增加胰高糖素样多肽-1的分泌，达到降低血糖、促进胰岛素分泌的作用。二甲双胍还有改善胰岛素抵抗，降低血浆胰岛素水平从而达到治疗DM的作用〔8,9〕。格列本脲是磺酰脲类降糖药，抑制肝糖原分解、糖异生作用，导致葡萄糖输出减少。总的作用为降低FPG和餐后血糖。对比格列本脲，二甲双胍不会改变DM患者的胰岛功能，对正常人几乎无作用，对DM降血糖作用明显〔10〕。CTGF和TGF-β1是各种肾脏病变纤维化发展过程中的重要标志物，对肾脏纤维化起到调节作用，逐渐成为新治疗靶点〔11〕。

本研究结果说明DM大鼠的肾脏功能有所损伤，二甲双胍和格列本脲处理后大鼠肾功能损伤程度有所缓解，二甲双胍大鼠缓解的程度更高。这其中的原因可能为：一方面二甲双胍可使AMP聚集，通过激活LKB1/AMPK信号通路，进而抑制DM大鼠肝细胞中腺苷酸环化酶的合成，机体对胰岛素的敏感性，进一步抑制肠道对葡萄糖的二次吸收，另一方面抑制糖原异生作用，从而DM大鼠血糖降低、HbA1c水平下降〔12,13〕。本研究结果说明DM大鼠肾功能发生明显损伤，肾组织的损伤机制较高，而在二甲双胍和格列本脲的作用下，肾组织损伤进一步得到改善，二甲双胍的作用尤为显著。这其中可能的原因为：DM状态下，CTGF表达增高，细胞有丝分裂和增殖功能增强，进一步刺激成纤维细胞的活化和增殖，推动成纤维细胞和肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化〔14〕，进而使得肾组织纤维化。表达增加的TGF-β1和CTGF通过刺激成纤维细胞增加使基质膜增厚导致肾实质功能障碍；另一方面TGF-β1通过抑制多种基质膜降解酶，纤连蛋白、层黏蛋白降解减少，导致基质膜增厚。同时诱导肾小管上皮细胞转变为肌成纤维细胞，导致基质膜变厚，使得肾功能逐步损伤〔15，16〕。而给予二甲双胍后，二甲双胍通过激活AMPK通路，激活下游P-乙酰辅酶A和mTORC1来发挥抗纤维化的作用。再者，二甲双胍激活AMPK后，降低活性氧簇的表达，进而氧化应激作用减少并进一步阻断TGF-β1的表达，从而阻断下游因子CTGF的表达，减弱成纤维细胞的生成作用，减少胶原Ⅰ等成分的生成，从而减少细胞外基质膜的增厚，保护肾脏功能，抑制DN的发展〔17,18〕。

综上，二甲双胍可有效控制DM大鼠血糖升高，同时降低DM大鼠肾组织中TGF-β1和CTGF的表达水平，延缓基底膜的增厚、抑制系膜基质的扩张、减少肾小球致密斑的形成，改善肾组织纤维化程度，保护肾脏。