三角梅CHS基因的克隆及表达分析

孙 蓉，刘 姗，高静雷，刁 毅，姜少娟，王胜男

(攀枝花学院 生物与化学工程学院,四川攀枝花 617000)

三角梅是中央种子目(Centrospermae)紫茉莉科(Nyctaginaceae)叶子花属(Bougainville)的一类常绿藤状灌木[1]。其色泽艳丽，花量繁盛，花型独特，四季开花，且耐旱耐盐，少病虫害，抗逆性强，可用于盆栽、绿篱也可用于园林绿化等[2]。作为景观植物，花色改良是其重要的育种目标，目前三角梅观赏品种约有100多个[3-4]，有红色系、橙色系、粉紫色系及白色系等[5]，但缺乏稀有的蓝 色花。

安田斉[6]认为蓝色花色的产生需要多个条件结合，包括大量的飞燕草素，适合的液泡pH及适量的助色素等，其中飞燕草素的积累是主要条件。研究表明利用基因工程技术向非蓝色花植物中引入飞燕草素合成途径关键酶基因可实现蓝色花色的培育，例如Holton[7]和Fukui等[8]将紫罗兰中飞燕草素合成的关键基因类黄酮-3′-5′-羟基化酶(flavonoid-3′,5′-hydroxylase,F3′5′H)转入白色康乃馨后获得了蓝紫色的花。同样地Katsumoto等[9]在月季中转入外源F3′5′H基因后飞燕草素开始积累，最终得到了蓝色的月季。而筛选适合的外源基因转入受体是关键。

查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花青素苷合成途径中的第一个关键酶及限速酶[10](图1)，催化3分子丙二酰辅酶A(malnoyl CoA)与1分子4-香豆酰辅酶A(4-coumaroyl-CoA)生成查尔酮(chalcone)，可为飞燕草素的合成提供基本的碳骨架。因此本研究基于前期三角梅转录组数据，筛选克隆CHS基因，利用MEGA5.05、ProParam、DNAMAN、Swiss-Model等生物信息学工具预测其蛋白的分子特性，并采用qRT-PCR技术分析基因表达特异性，为该基因的表达调控及功能验证提供基础材料，为蓝色三角梅转基因受体的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择1～2 a生完全木质化，粗细长短相近的各色系单色单瓣三角梅[白色的‘新加坡大白(B.glabra‘Singapore White’)’，粉红色的‘中国丽人(B.×buttiana‘China Beauty’)’，红色的‘花叶大红(B.×buttiana‘Brilliant Variegata’)’，橙色的‘宝老橙(B.×buttiana‘Baolao Cheng’)’，黄色的‘黄蝶(B.×spectoglabra‘Ratana Yellow’)’及紫色的‘安格斯(B.‘Elizabeth Angus’)’]枝条于2018年6月扦插种植于攀枝花学院苗圃，以盛花期的苞片和叶片为试验材料。

1.2 查尔酮合酶基因的克隆

根据干热河谷特色生物资源开发四川省高校重点实验室测序获得的白色三角梅苞片转录组数据，以注释信息、基因表达丰度、序列长度等为条件，筛选花青素合成途径中的CHS基因，手动筛除不同注释库的重复项，并通过BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对确定完整性。根据所得序列设计一对特异引物，上游引物BsCHSF:ATGAATTCTCCATCACTTGATGAAA及下游引物BsCHSR:TTATAGTGGAACACTATGAAGCACA。以白色三角梅叶片cDNA第一链为模板，利用PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa)扩增BsCHS基因cDNA全长，25 μL反应体系中PrimeSTAR Max Premix (2×) 12.5 μL，BsCHSF (10 μmol/L) 0.5 μL，BsCHSR(10 μmol/L) 0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 10.5 μL；PCR反应程序：98 ℃变性10 s；55 ℃退火 5 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，为保证充分扩增72 ℃继续延伸10 min。利用超薄DNA产物纯化试剂盒(天根)纯化回收PCR产物，送上海英潍捷基贸易有限公司测序验证。

1.3 序列分析

利用DNAMAN软件结合WebLoGo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)在线系统解析CHS保守基序的序列特征；通过SMART (http://smart.embl.de/)在线工具搜索功能结构域；采用ExPASy系统的ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)工具分析表达蛋白的基本理化性质及三级结构；应用CBS研究所在线预测服务系统的TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM- 2.0/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)工具预测表达蛋白的跨膜区域及信号肽；SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sspred.html)方法用于预测二级结构；使用MEGA 5.05软件构建系统进化树，建树方法为比邻法(Neighbor-Joining)，自举重复(Bootstrap replications)的重复次数为1 000次。

1.4 基因表达量分析

1.5 数据处理

每个花色叶片及苞片进行2次生物学重复，3次技术重复。以表达量最低的材料为对照，利用2-ΔΔCT法计算目的基因在不同花色中的相对表达量，并通过SPSS 20.0进行显著性分析，Origin 2018软件绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 三角梅CHS基因的克隆

根据三角梅转录组注释信息库的基因名称和功能注释，成功筛选获得了1条CHS基因序列(Bs104454)，通过BLAST比对显示Bs104454基因开放阅读框完整且与其他植物CHS同源，根据该序列设计引物，扩增获得了一条长为1 176 bp的cDNA序列，编码392个氨基酸，测序结果与预期相吻合，将其命名为BsCHS，提交GenBank，登录号为MT302539(图2)。

2.2 BsCHS蛋白基本理化性质分析

根据ProtParam工具预测，BsCHS理论相对分子质量为43.96 ku，等电点为6.24，含量最多的氨基酸为亮氨酸(Leu)含10.5%，其总负电荷残基数为50，正电荷残基数为45，分子式为C1964H3129N537O568S19，总原子数为6217，不稳定系数及平均总亲水系数分别为53.18和-0.067，表明BsCHS为不稳定的亲水性蛋白。

2.3 BsCHS蛋白结构分析

2.3.1 保守结构域 不同植物间，查尔酮合酶蛋白较为保守，相似性为74%～98%，多序列比对结果(图3)与此相符合，BsCHS与其余植物中CHS序列相似性为85.43%，具有CHS特有的保守基序(图4)，在这些区域存在4个活性中心位点，其中Cys164是底物4-香豆酰辅酶A(4-coumaroyl-CoA)的结合位点；His303和Asn336主要参与催化底物丙二酰辅酶A(malnoyl CoA)脱羧的反应；Phe215与底物特异性选择相关[12]。

2.3.2 信号肽及跨膜结构 信号肽的主要作用是引导新合成的多肽在胞内运输，以到达不同的细胞器内，具有指导多肽跨膜转移的作用。经SignalP 5.0在线工具预测显示BsCHS不含有信号肽序列，TMHMM跨膜结构的预测结果也与此相符，不含有跨膜结构。进一步利用ProtCompv.9.0预测其亚细胞定位，发现定位于细胞质，该结果与上述结果相吻合。说明BsCHS为非分泌型的细胞质蛋白。

2.3.3 功能结构域及二级结构 结构域是一种介于二级和三级结构之间的蛋白功能单元，不同的结构域往往与不同的功能相联系，结构域信息对于预测蛋白质间相互作用具有重要价值[13]。利用SMART在线工具预测BsCHS结构域，结果显示其含有4个结构域，其中Chal_sti_synt_N和Chal_sti_synt_C为查尔酮合酶特征结构域，富含活性位点，与底物特异结合有关，C端的活性差异与N端序列的差异有关。另外两个为FAE1_CUT1_RppA和ACP_syn_Ⅲ与脂肪酸合成 相关。

由SOPMA预测结果可知(图5)，BsCHS二级结构组成中比例最高的为α螺旋，占44.25%；其次为无规则卷曲占36.06%，延伸链占 14.32%，最少的为β转角占5.37%。

2.3.4 BsCHS三级结构预测 蛋白质的结构决定着蛋白质的功能，因此研究其高级结构对认识蛋白质功能，了解蛋白质作用方式具有重要意义[14]。利用SWISS-MODEL在线预测系统的同源建模法构建BsCHS的三级结构，参考模板为水稻(OryzaSativa)中的4yjy.1.A查尔酮合酶，序列相似性为57.62%。结果显示(图6)BsCHS为二聚体蛋白，各二级结构含量也与SOPMA预测结果相吻合。

2.4 BsCHS蛋白的分子进化分析

以单子叶植物玉米CHS蛋白序列为外类群，与蔷薇目的大豆、绿豆，管状花目的烟草、黄芩，百合超目的虎眼万年青、黑麦，蓼目的虎杖、苦荞麦，以及中央种子目的甜菜、菠菜、石竹等中的CHS蛋白序列构建系统进化树，结果显示(图7)虽BsCHS蛋白单独聚为一支，但与同为中央种子目的植物亲缘关系较近，符合系统进化关系。

2.5 BsCHS在不同花色中的表达模式

利用qRT-PCR技术检测BsCHS基因在不同颜色三角梅苞片及叶片中的表达情况(图8)，以表达量最低的红色叶片为参照，进行其他材料中表达量的计算。结果显示BsCHS基因在黄色、白色及紫色三角梅中表达量较高，其中在黄色三角梅叶片及苞片中的表达量是红色叶片的24倍及22倍，而粉色苞片中的表达量是叶片中的10倍。大部分苞片表达量高于叶片，因此推测苞片比叶片更适用于研究三角梅花青素合成途径，且黄色及白色可优先考虑作为蓝色三角梅转基因受体，但还需进一步对其色素种类及含量进行研究来确定。

3 讨 论

随着人们生活水平的不断提高，对新异花卉品种的追求越来越强烈，其中蓝色花卉更是广受欢迎。研究表明蓝色花的形成需要一种花青素——飞燕草素及适合的呈色环境。三角梅之所以没有蓝色的花，主要原因是使其呈色的色素为甜菜色素，该色素与花青素排斥分布，在同一植物中无法同时合成这两种色素[15]。但有报道显示积累甜菜色素的植物也可以合成黄酮，类黄酮甚至原花青素，而其最后一步花青素合酶的缺失可能是导致其不能合成花青素的原因[16]。基于基因工程手段的分子育种可打破此现状，通过对代谢途径的调控改造达到目的产物的合成，从而实现花色定向培育。然而花青素合酶的转化需要受体本身可以合成其催化底物。CHS作为花青素合成途径的核心酶，一方面其可以为花青素苷的合成提供前体物质，另一方面其自身表达量的高低也会影响花色的呈现[17]。因此研究花卉CHS基因对花色改良具有重要意义。

中央种子目植物(除了石竹科Caryophyllaceae和粟米草科Molluginaceae)是被子植物中唯一一个以甜菜色素为主要花色素的目，其中藜科已有CHS基因序列的相关报道，而紫茉莉科中尚未见报道，本研究首次从紫茉莉科植物中获得了CHS基因。该基因含有一个1 176 bp的开放阅读框，编码43.96 ku的蛋白，对其三级结构的预测表明其含有2个亚基，该结果与Springob等[18]的研究结果相符，他们通过X-射线衍射研究

CHS蛋白三维结构时发现CHS是一个二聚体蛋白，且每个亚基分子质量在40～50 ku之间；对蛋白性质预测结果表明BsCHS为亲水性蛋白，与方建[19]及冯立娟等[20]对CHS基因克隆研究结果一致；通过信号肽、跨膜结构及亚细胞定位分析，BsCHS属于细胞质蛋白符合前人报道[21]；序列比对及结构域分析表明BsCHS含有查尔酮合酶特征保守结构域及活性中心保守氨基酸，以上结果显示本研究筛选获得的三角梅CHS基因符合植物CHS基因特性，具有CHS生物活性，可用于后续研究。

次生代谢物的合成需要经过多个复杂且多分支的途径，对这些途径中限速酶的研究鉴定是解析代谢途径的关键步骤。关键酶基因表达量的高低会影响代谢产物的积累，因此本研究利用qRT-PCR技术检测了BsCHS基因在不同花色三角梅中的表达情况，以期获得最适的转基因受体，结果显示在黄色三角梅苞片及叶片中BsCHS的表达量均较高，推测其可以为飞燕草素的合成提供更多的前体物质，更适用于三角梅花青素合成途径的研究，后续可通过高效液相色谱等方法进行代谢物含量测定以验证该推测。

花色改良一直是花卉育种者的研究热点，传统育种方式受到多种因素的限制，难以有大突破，基于现代生物技术的分子育种为花卉育种提供了新思路。本研究对三角梅CHS基因的研究，为三角梅新花色的培育提供了新方向，但仍需进一步对BsCHS基因功能进行验证及研究如何抑制甜菜色素合成途径让代谢流进入花青素合成途径，才能最终达到对蓝色三角梅培育的目的。