金黄色葡萄球菌性奶牛乳房炎调查及菌株耐药性和毒力分析

刘肖利，刘璐瑶，李镔罡，裴文刚，李 斌，程 彪，苏战强，李勤凡

(1.新疆农业大学 动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.西北农林科技大学 动物医学院，陕西杨凌 712100)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是引起奶牛乳房炎的主要病原菌，在某些奶牛场感染率达50%以上[1]，乳房炎不仅损害动物健康，同时给奶产业生产造成了严重的经济损失，影响乳制品品质，危及人类健康[2-3]。金黄色葡萄球菌对常用的抗菌药物极易产生耐药性，由其导致的奶牛乳房炎一般很难治愈[4]。金黄色葡萄球菌致病力的强弱主要取决于其产生的各种毒素和侵袭性酶[5-7]，包括α-溶血素(hemolysin-α，hla)、β-溶血素(hemolysin-β，hlb)、肠毒素(Staphylococcal enterotoxins，SEs)、休克综合-1毒素(toxicshock syndrome toxin-1，tsst-1)、凝集因子A(clumping factor A，clfa)、杀白细胞素(panton valentine leukocidin，pvl)、纤连蛋白结合蛋白(fibronectin binding protein，fnBP)、耐热核酸酶(thermostable nuclease，nuc)等[8-10]。

新疆是中国五大牧区之一，具有独特的养殖地理环境。奶牛品种主要包括中国荷斯坦奶牛、西门塔尔牛、新疆褐牛及改良的新疆本地品种牛。截止2017年，新疆地区奶牛的存栏数已增至269.0万，年均产奶量增至330.0万t。但乳房炎的频发导致产奶量不断下降，严重影响本地奶牛养殖业的发展。本研究对新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉地区7个奶牛场采集的乳房炎样本进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定、耐药性检测，同时利用PCR方法对分离菌株的毒力基因进行检测，对小鼠进行攻毒试验，分析目前新疆部分地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌的耐药情况及毒力因子的流行情况，为牛场奶牛乳房炎防控措施的制定和评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本采集及处理

2019年9月—2020年6月，在新疆乌鲁木齐、伊犁、昌吉地区7个奶牛场(奶牛场编号为 A～G)随机采集患乳房炎奶牛乳汁样本15～25份，共采集142头患乳房炎奶牛的乳汁样本142份。采集乳样时使用温水将患病奶牛的乳头清洗干净后，再用体积分数75%的酒精棉擦拭消毒乳头，使用消毒纸巾擦干后，弃去前3把乳汁，用无菌管采集第3把以后的乳汁约50 mL，将样品分别标记后，放入采样箱中送实验室检测。

1.2 主要试剂

革兰氏染色液购自珠海贝索生物技术有限公司；脑心浸出液肉汤(Brain Heart Infusion Broth BHI)、Mueller-Hinton琼脂(MH)、Baird-Parker琼脂、亚碲酸盐卵黄增菌液、细菌微量生化管(过氧化氢酶)、细菌微量生化管(兔血浆)均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；5%绵羊血平板为自制(百分数表示体积分数)；2×TaqPCR Master Mix、ddH2O均购自生工生物(上海)股份有限公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；16种葡萄球菌属生化鉴定管、13种常用抗菌药物(氧氟沙星、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、头孢唑啉、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素、复方新诺明、四环素)均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.3 主要仪器

普通光学显微镜购自Nikon公司；净化工作台(型号：SW-CJ-2FD)购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DYY-7C型电泳仪购自北京市六一仪器厂；PCR扩增仪购自Eppendorf公司；电热恒威培养箱(型号：DHP-9082B)购自上海恒科学仪器有限公司；恒温振荡器(型号：TS-2102C)购自山海天呈实验仪器制造有限公司；高温高压灭菌锅(型号：HVE-50)购自日本Hirayayama制造公司；凝胶成像分析系统(TRANSILLUMINATOR JVLABO)。

1.4 试验动物

60只健康昆明系小白鼠，雌雄各半，体质量20～25 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.5 金黄色葡萄球菌分离鉴定

1.5.1 金黄色葡萄球菌的初筛 将采集的乳汁样本加入BHI液体培养基，于摇床37 ℃增菌培养18～24 h后，无菌操作涂布于5%绵羊血平板和Baird-Parker琼脂平板上，于37 ℃恒温培养24～48 h后，挑取疑似金黄色葡萄球菌的单个菌落进行革兰氏染色、镜检，并接种于LB琼脂进行纯化培养，-20 ℃保存。

1.5.2 生化鉴定 接触酶试验：在载玻片上滴加1～2滴体积分数3% H2O2，挑取疑似金黄色葡萄球菌的单菌落与H2O2充分混合后，观察有无气泡产生，如有气泡产生则判定为阳性，无气泡产生则判定为阴性[11]。血浆凝固酶试验：取20 μL BHI培养物加入有血浆凝固酶的安瓿瓶中，充分混匀后放入恒温箱37 ℃培养，每隔30 min观察1次，连续观察6 h，如出现凝固或者大量凝块则判定为阳性；并设生理盐水阴性对照[12]。将纯化后的金黄色葡萄球菌疑似菌株增菌培养后进行生化鉴定，鉴定方法及结果判定按葡萄球菌属细菌生化鉴定编码册(TH-16S)进行。

1.5.3 分离菌株16S rDNA序列扩增 (1)基因组DNA的提取：采用水煮法提取分离菌株的基因组DNA。分离菌株37 ℃震荡培养18～ 24 h，12 000 r/min离心菌液3 min，弃上清，使用生理盐水反复冲洗2次，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min离心3 min，取上清，-20 ℃保存，备用。

(2)PCR鉴定：使用参考文献[13]报道的细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增(表1)。50 μL反应体系包括2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，提取的分离菌株基因组DNA模板1 μL，ddH2O补至50 μL；反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min；然后取6 μL PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶在1×TAE电泳液中电泳，电压120 V，电泳时间30 min，经紫外凝胶成像后统计结果；并将有明亮条带的对应PCR产物送上海生工生物工程有限责任公司测序。

1.6 分离菌株耐药性检测

采用K-B纸片扩散法选取13种常用的药敏纸片(氧氟沙星、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、头孢唑啉、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林、青霉素G、克林霉素、红霉素、复方新诺明、四环素)进行药敏试验；从Baird-Parker琼脂平板上挑取单菌落接种于BHI肉汤过夜增菌培养后，将菌液浓度调至0.5麦氏比浊管，取200 μL均匀涂布于MH培养基上，13种抗菌药物纸片分别贴于培养基表面，37 ℃恒温培养8～12 h，测量抑菌圈直径。药敏试验结果根据美国临床实验室国家标准化委员会( NCCLS) 制定的标准判定[14]。

1.7 分离菌株毒力基因检测

根据参考文献[15-16]中报道的引物序列，合成金黄色葡萄球菌毒力基因nuc、pvl、fnbA、fnbB、hla、hlb、sea、seb、eta、etb、tsst-1、clfA共12对特异性引物，并送上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。12种毒力基因PCR扩增反应体系相同，反应体系25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O补至25 μL。nuc基因的PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸7 min。pvl、fnbA、fnbB、hla、hlb、sea、seb、eta、etb、tsst-1、clfA基因的PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，经紫外凝胶成像后统计结果。

1.8 小鼠攻毒试验

60只健康昆明系小白鼠随机分为6组，5个试验组命名为A～E组，另设1组为对照组。将分离菌株分别接种于BHI肉汤培养基，于37 ℃摇床增菌18～24 h；用生理盐水将菌液稀释至 1×108CFU/mL，试验前小鼠禁食禁水12 h，试验组小鼠分别腹腔注射分离菌株肉汤培养物 0.5 mL，对照组小鼠注射等量生理盐水，观察24～ 48 h内小鼠精神状态、食欲、发病和死亡情况等。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌分离鉴定结果

从7个奶牛场采集的142份患乳房炎奶牛乳汁样本中共分离出5株疑似金黄色葡萄球菌，其中昌吉地区B牛场分离到2株，分离率为7.14%(2/28)，乌鲁木齐地区G牛场中分离到3株，分离率为8.82%(3/34)；其余5个奶牛场的样本中均未检出。疑似菌株在5%绵羊血平板上形成表面光滑、湿润、隆起的灰白色圆形菌落，呈 β 溶血(图1)；在Baird-Parker琼脂平板上形成的菌落为黑色，周围有灰白色浑浊带，最外围有透明环(图2)。镜检结果显示，分离菌株均为革兰氏阳性球菌，以单个、成对或葡萄状存在(图3)。

分离菌株接触酶试验、凝固酶试验结果全为阳性；根据表2结果，结合葡萄球菌属细菌生化鉴定编码册(TH-16S)，初步确定5株分离菌株均为金黄色葡萄球菌。

表2 疑似分离菌株生化试验结果Table 2 Results of biochemical test of suspected isolates

以5株分离菌基因组DNA为模板，以通用引物采用PCR方法扩增其16S rDNA基因片段，在1 500 bp处出现明亮条带(图4)，长度与预期目的片段大小相符。测序结果经BLAST分析比对，显示5株分离菌株与金黄色葡萄球菌的同源性均达99 %，结合生化试验结果，确定分离菌株均为金黄色葡萄球菌。

2.2 分离菌株耐药性检测结果

使用9大类13种抗菌药物对5株金黄色葡萄球菌进行药物敏感性试验。结果显示，5株金黄色葡萄球菌分离株最少耐1种抗生素，最多耐5种抗生素(图5)；对青霉素类中的青霉素G和β-内酰胺类中的氨苄西林耐药率均高达80%；对链霉素、头孢他啶和阿莫西林的耐药率较高，耐药率均为60%；对红霉素的耐药率为20%；对氧氟沙星、庆大霉素、头孢唑啉、四环素、复方新诺明、克林霉素、环丙沙星全部敏感(图6)。

2.3 金黄色葡萄球菌分离株毒力基因PCR检测结果

对5株奶牛源乳房炎金黄色葡萄球菌分离株的毒力基因进行PCR检测。结果显示，12种毒力基因中检出nuc、clfa、eta、sea、fnbB5种，目的条带大小分别为400 bp、292 bp、676 bp、560 bp、524 bp；pvl、fnbA、hla、hlb、seb、etb、tsst-1基因未检测出(图7)。

所有分离的金黄色葡萄球菌菌株均含有2种以上的毒力基因，检出率分别是nuc(100%)、clfa(100%)、fnbB(60%)、sea(20%)、eta(20%)(图 8)；从分离的金黄色葡萄球菌菌株中检出的5个毒力基因共有3种毒力基因组合(图 9)，其中nuc、clfa基因组合在B牛场被检菌株中较为流行，nuc、clfa、fnbB基因组合在G牛场被检菌株中较为流行。

2.4 小鼠攻毒试验结果

小鼠腹腔注射攻毒菌液8～12 h后，小鼠均出现精神沉郁、全身发抖、喜卧等症状，试验组小鼠24～48 h内均出现死亡，A组死亡10只，B组、C组、D组均死亡8只，E组死亡6只，死亡率分别为100%、80%、80%、80%、60%；解剖死亡小鼠可见肝肿大，脾、肾有出血点，从死亡小鼠的肝脾等器官中能分离到接种的金黄色葡萄球菌；对照组小鼠正常。

3 讨 论

奶牛乳房炎是全球范围内危害奶牛业经济效益的一种重要疾病，严重影响着各国乳制品行业的发展。金黄葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌之一。本研究从142份患乳房炎奶牛乳汁样本中共分离出5株金黄色葡萄球菌，7个奶牛场有2个牛场检出并分离到金黄色葡萄球菌，分离率分别为7.14%(2/28)和8.82%(3/34)。Normanno等[17]报道的意大利牛奶、乳制品、肉类、肉制品等动物源性食品样本中金黄色葡萄球菌的分离率为9.79%，张行等[18]报道的中国奶牛养殖区乳房炎金黄色葡萄球菌的分离率为 8.75%；邹佳琪等[19]报道的南宁地区某奶牛场奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的分离率为6.8%，与本试验结果基本一致。在王帅等[20]的研究中，北疆地区奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌的分离率为50%；欧都等[21]报道的新疆石河子地区奶牛隐性乳房炎源金黄色葡萄球菌的分离率为44.71%，均高于本试验结果。造成金黄色葡萄球菌分离率的差异性可能与不同奶牛场流行菌种有关。

近年来，奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌耐药菌株数呈不断增加的趋势，其耐药性也不断增强。本研究对5株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离株进行药物敏感性检测，分离株对氧氟沙星、庆大霉素、头孢唑啉、四环素、复方新诺明等多数抗菌药物敏感，由于不同场区分离的菌株耐药性有所差异，本研究结果只能为菌株来源场治疗乳房炎药物选择提供参考；分离株对青霉素G、氨苄西林、链霉素、头孢他啶、红霉素、阿莫西林的耐药率为20%～80%，其中对青霉素G和氨苄西林耐药率最高为80%。多项研究报道[22-24]，北疆地区奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌对青霉素类、β-内酰胺类抗生素的耐药率均高于本试验结果。耐药性结果表明，目前新疆部分地区奶牛场乳房炎金黄色葡萄球菌耐药性不强，不同奶牛场金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感程度可能与奶牛场使用抗生素习惯不同有关。

金黄色葡萄球菌的致病性与其携带的毒力基因有关。本研究通过PCR方法对5株金黄色葡萄球菌分离株的12种常见毒力基因进行检测，共检测出nuc、clfa、fnbB、sea、eta5种毒力基因，其余毒力基因均未检出。Salasia等[25]报道牛乳房炎源金黄色葡萄球菌的毒力基因检测结果与本试验结果一致，均为nuc、fnbA、hla较高。Sharma等[26]报道的牛乳源金黄色葡萄球菌毒力基因检测结果与本研究结果不完全一致，其中fnbB基因检出率高于本研究结果，而clfa、sea基因检出率远低于本研究结果。王新等[27]报道的陕西地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌pvl毒力基因检出率较高，seb、sed、sea、sej基因检出率较低，与本结果有差异。在杨波等[28]的研究中，新疆乌鲁木齐周边奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌主要携带nuc、clfa、fnbA和hla基因，而在本研究中，nuc、clfa和fnbB基因的检出率较高，说明fnbB基因可能是新疆地区新增的流行毒力基因。在不同地区引起奶牛乳房炎的金黄色葡萄球菌携带的毒力基因分布有所区别，可能存在地域性差异。小鼠攻毒试验结果表明，本研究分离的金黄色葡萄球菌均具有较强的致病性，这可能是导致奶牛乳房炎的主要原因，且菌株具有一定程度的耐 药性。

4 结 论

新疆部分地区由金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎感染情况较为严重，分离菌株具有一定的耐药性，携带多个毒力基因且致病性较强。