大蒜提取物对小鼠肠道菌群调节作用研究

贾世栋，杨 浩,宋百灵，张春子，毛旭文,4

（1新疆医科大学药学院，2新疆医科大学第六附属医院药学部，3埃乐欣药业有限公司，4天然药物活性组分与释药技术重点实验室，乌鲁木齐 830011）

大蒜（Allium sativumL.）为百合科葱属植物的根茎，其主要化学成分为蒜氨酸，含量占0.5%～2.0%。蒜氨酸与蒜酶在碾碎时接触，快速反应产生大蒜辣素[1]。大蒜具有多种药理活性，能够明显杀灭或抑制细菌、真菌、病毒，如：痢疾杆菌、伤寒杆菌、白色念珠菌、流感病毒、牛痘病毒等[2-3]。除此以外，大蒜还具有保护心血管系统[4]、调节血糖水平[5]、缓解疲劳[6]、抗肿瘤[7]等药理活性；虽然国内外对大蒜的研究日趋增多，但是关于大蒜对肠道菌群的益生作用还鲜有报道。新疆生产的大蒜优质个大，生物活性成份含量较高，为大蒜制剂提供了优良原料。本文采用菌落计数法探究健康小鼠灌胃蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉前后肠道菌群变化，评价大蒜提取物的潜在益生元特性，现报到如下。

1 材料与方法

1.1 仪器MLS-3750型高压蒸汽灭菌器（韩国SANYO公司），AC-S型洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），DNP-9082型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），E200型厌氧培养箱（美国Gene Sciense公司）。

1.2 试药伊红美蓝琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：1012105），BBL琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：100315），LBS琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：100929），TSC琼脂培养基（青岛海博生物技术有限公司，批号：1009032），改良GAM琼脂培养基厂家（青岛海博生物技术有限公司，批号：1009032），叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂培养基（北京陆桥技术有限责任公司，批号：1003251），蒜氨酸（新疆埃乐欣药业有限公司，批号：20090101，纯度84.88%），蒜酶（新疆埃乐欣药业有限公司，批号：201801003），冻干蒜粉（新疆埃乐欣药业有限公司，批号：Y201811001）。

1.3 动物选取SPF级C57BL/6J小鼠100只（购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号1140700321501，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006），雌雄对半，6～8周龄，体质量22～25 g。SPF级实验动物使用许可证号SYXK（新）2016-0002，光照12 h/d，黑暗12 h/d，温度（21±2）℃，湿度（40%～45%）。本实验经过新疆医科大学实验动物中心伦理委员会批准。

1.4 方法

1.4.1 动物分组及给药 SPF级C57BL/6J小鼠随机分成10组：空白对照组（灌胃蒸馏水，灌胃剂量0.1 mL/10g体质量），蒜氨酸低（0.0004 3 mg/g体质量）、中（0.008 6 mg/g体质量）、高（0.017 2 mg/g体质量）剂量组，大蒜辣素低（0.001 9 mg/g体质量）、中（0.003 9 mg/g体质量）、高（0.007 8 mg/g体质量）剂量组，大蒜粉低（0.110 8 mg/g体质量）、中（0.221 6 mg/g体质量）、高（0.443 2 mg/g体质量）剂量组，，每组10只。以不同浓度的蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉溶液灌胃，灌胃剂量0.1 mL/10 g，1次/d，连续给予30 d。

1.4.2 靶标菌培养 收集各组小鼠给药前后新鲜粪便于灭菌收集EP管中，称取粪便，加生理盐水，粪便重量与生理盐水配比为0.1 g:2 mL，立即将EP管封口，涡旋混匀5 min。将粪便混悬液10倍系列稀释10 000倍，接种于培养基，37℃培养，培养基种类及其培养条件，见表1。

表1 细菌培养基种类及其培养条件

1.5 指标的测定

1.5.1 体质量的测定 实验期间每天同一时间测定小鼠体质量。

1.5.2 靶标菌菌落计数 将培养好的细菌经16sRNA测序鉴定后，计算每克粪便中细菌数量CFU/g=X/0.05×稀释倍数/标本质量（g）。式中X同一稀释度平均菌落数。结果用常用对数值Lg CFU/g表示。

1.5.3 K-B纸片扩散法体外抑菌实验 挑取少量上述5种菌培养基，用平板划线法在MRS固体培养基平板上划线分离纯化菌种。取直径为6 mm的灭菌滤纸片，放入不同浓度的大蒜提物溶液中浸泡12 h，取出后放至无菌平皿中风干备用。挑取培养基上分离纯化后的单个菌落溶于生理盐水中，制成0.5个麦氏单位的菌悬液。吸取100μL菌悬液/板，接种于MRS固体培养基。用无菌镊子取纸片紧贴于培养皿表面。每个平板等距离贴3片，每组3个平行样。将贴好纸片的培养皿置于37℃温箱孵育24 h。培养结束后，用游标卡尺测量抑菌环的直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，根据抑菌环直径大小、《纸片法抗菌药物敏感试验标准（WS/T125-1999）》[8]判断细菌对药物的敏感性，试验标准：抑菌圈直径等于0 mm为不敏；小于10 mm为低敏；在10～14 mm之间为中敏；在15～20 mm之间为高敏；大于20 mm，为极敏。

1.6 统计学处理采用GraphPad统计学软件分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜提取物对小鼠体质量影响与空白对照组比较，蒜氨酸低、中、高剂量组灌胃第2、3、4周后体质量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白对照组比较，大蒜辣素低、中、高剂量组灌胃第2、3、4周后体质量降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与空白对照组比较，大蒜粉低、中、高剂量组灌胃第2、3、4周后体质量降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表2～4。

表2 蒜氨酸干预后小鼠在28 d内的体质量的变化（±s，g）

表2 蒜氨酸干预后小鼠在28 d内的体质量的变化（±s，g）

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01。

时间/周1 2 3 4 总和空白对照组170.31±8.92 172.52±8.78 172.83±8.51 174.41±8.29 690.06±33.66蒜氨酸低剂量组171.89±5.26 168.18±8.22 164.64±12.26 161.32±12.48*666.02±36.06蒜氨酸中剂量组168.39±6.86 165.03±7.76 162.86±5.92*160.02±5.28**656.29±24.90*蒜氨酸高剂量组163.03±9.47 157.61±11.26*154.98±10.86**151.52±10.78**627.13±39.59**

表3 大蒜辣素干预后小鼠在28 d内的体质量的变化（±s，g）

表3 大蒜辣素干预后小鼠在28 d内的体质量的变化（±s，g）

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

时间/周1 2 3 4 总和空白对照组170.31±8.92 172.52±8.78 172.83±8.51 174.41±8.29 690.06±33.66大蒜辣素低剂量组169.09±6.53 165.24±7.66 163.52±5.63*160.76±5.63**658.60±23.80大蒜辣素中剂量组164.08±7.05 156.21±9.39**154.42±8.67**152.39±8.70**627.10±32.66**大蒜辣素高剂量组166.88±6.20 157.12±10.85**154.91±10.43**152.29±9.97**631.19±37.22**

表4 大蒜粉干预后小鼠在28 d内体质量的变化（±s,g）

表4 大蒜粉干预后小鼠在28 d内体质量的变化（±s,g）

注：与空白对照组比较,*P<0.05，**P<0.01。

时间/周1 2 3 4 总和空白对照组170.31±8.92 172.52±8.78 172.83±8.51 174.41±8.29 690.06±33.66大蒜粉低剂量组169.51±9.33 163.77±13.36 159.74±12.30*155.65±11.18**648.66±45.83大蒜粉中剂量组165.27±9.97 158.76±13.30*150.82±14.37**144.03±16.14**618.87±51.69**大蒜粉高剂量组169.93±6.87 165.87±7.08 161.21±5.91**157.19±6.25**654.19±22.09

2.2 靶标菌菌落计数与空白对照组比较，蒜氨酸低、中、高剂量组乳杆菌、双歧杆菌数量明显增加，产气荚膜梭菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。灌胃30 d前后自身比较，蒜氨酸低、中、高剂量组乳杆菌、双歧杆菌数量明显增加，产气荚膜梭菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。与空白对照组比较，大蒜辣素低、中、高剂量组乳杆菌、双歧杆菌数量明显增加，产气荚膜梭菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。灌胃30 d前后自身比较，大蒜辣素低、中、高剂量组乳杆菌、双歧杆菌数量明显增加，产气荚膜梭菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。与空白对照组比较，大蒜粉低、中、高剂量组乳杆菌、双歧杆菌数量明显增加，产气荚膜梭菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）。灌胃30 d前后自身比较，大蒜粉低、中、高剂量组乳杆菌、双歧杆菌数量明显增加，产气荚膜梭菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.01）,见表5～7。

表5 灌服蒜氨酸前后小鼠肠道5种菌落计数（Log CFU，±s）

表5 灌服蒜氨酸前后小鼠肠道5种菌落计数（Log CFU，±s）

注：与给药后对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与本组给药前相比，#P<0.05，##P<0.01。

菌种乳杆菌双歧杆菌肠杆菌肠球菌产气荚膜梭菌空白对照组灌服前7.88±0.23 8.90±0.24 7.49±0.33 7.18±0.34 7.05±0.33灌服后7.88±0.14 8.82±0.21 7.54±0.10 7.17±0.17 7.07±0.20低剂量组灌服前7.80±0.16 8.81±0.17 7.42±0.29 7.14±0.28 6.99±0.26灌服后8.33±0.15**##9.39±0.17**##7.56±0.18 7.20±0.32 6.37±0.31**##中剂量组灌服前7.85±0.20 8.86±0.20 7.47±0.22 7.03±0.40 7.05±0.22灌服后8.29±0.21**##9.36±0.15**##7.53±0.25 7.22±0.20 6.32±0.29**##高剂量组灌服前7.78±0.29 8.81±0.30 7.41±0.32 7.01±0.42 6.99±0.31灌服后8.35±0.22**##9.43±0.17**##7.59±0.14 7.17±0.41 6.45±0.23**##

表6 灌服大蒜辣素前后小鼠肠道5种菌落计数（Log CFU，±s）

表6 灌服大蒜辣素前后小鼠肠道5种菌落计数（Log CFU，±s）

注：与给药后对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与本组给药前相比，#P<0.05，##P<0.01。

菌种乳杆菌双歧杆菌肠杆菌肠球菌产气荚膜梭菌空白对照组灌服前7.88±0.23 8.90±0.24 7.49±0.33 7.18±0.34 7.05±0.33灌服后7.95±0.10 8.99±0.10 7.61±0.20 7.10±0.48 7.15±0.19低剂量组灌服前7.83±0.20 8.84±0.23 7.46±0.33 7.06±0.36 7.04±0.32灌服后8.27±0.10**##9.33±0.12**##7.52±0.18 7.18±0.28 6.18±0.40**##中剂量组灌服前7.71±0.28 8.72±0.28 7.35±0.39 7.09±0.26 6.91±0.35灌服后8.27±0.17**##9.32±0.17**##7.51±0.12 7.18±0.25 6.37±0.35**##高剂量组灌服前7.78±0.14 8.80±0.10 7.38±0.33 7.08±0.32 7.02±0.19灌服后8.36±0.11**##9.42±0.09**##7.61±0.12 7.30±0.15 6.35±0.40**##

表7 灌服大蒜粉前后小鼠肠道5种菌落计数（Log CFU，±s）

表7 灌服大蒜粉前后小鼠肠道5种菌落计数（Log CFU，±s）

注：与给药后对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与本组给药前相比，#P<0.05，##P<0.01。

菌种乳杆菌双歧杆菌肠杆菌肠球菌产气荚膜梭菌空白对照组灌服前7.88±0.23 8.90±0.24 7.49±0.33 7.18±0.34 7.05±0.33灌服后7.95±0.10 8.99±0.10 7.61±0.20 7.10±0.48 7.15±0.19低剂量组灌服前7.88±0.23 8.89±0.23 7.47±0.32 7.20±0.44 7.16±0.28灌服后8.33±0.14**##9.40±0.15**##7.58±0.23 7.18±0.27 6.39±0.31**##中剂量组灌服前7.83±0.20 8.87±0.18 7.42±0.30 7.05±0.34 7.06±0.22灌服后8.34±0.17**##9.41±0.16**##7.59±0.26 7.25±0.24 6.30±0.34**##高剂量组灌服前7.78±0.21 8.83±0.17 7.44±0.26 7.13±0.29 7.01±0.24灌服后8.43±0.18**##9.50±0.18**##7.67±0.20 7.32±0.29 6.30±0.43**##

2.3 大蒜提取物对5种菌的体外抑菌作用肠球菌对低、中、高剂量蒜氨酸均为低敏；产气荚膜梭菌对低、中、高剂量蒜氨酸均为低敏；乳杆菌、双歧杆菌、肠杆菌对低、中、高剂量蒜氨酸均不敏。乳杆菌对低、中、高剂量大蒜辣素分别为低敏、中敏、高敏；产气荚膜梭菌、肠杆菌对低剂量大蒜辣素为低敏，对中剂量、高剂量大蒜辣素均为中敏；肠球菌对低剂量大蒜辣素为中敏，对中剂量、高剂量大蒜辣素均为高敏；双歧杆菌对低、中、高剂量大蒜辣素为不敏。乳杆菌对低剂量、中剂量大蒜粉为中敏，对高剂量大蒜粉为高敏；肠杆菌对低剂量、中剂量大蒜粉均为低敏，对高剂量大蒜粉为中敏；肠球菌、产气荚膜梭菌大蒜粉低、中、高剂量均为低敏。双歧杆菌对低、中、高剂量大蒜粉为不敏，见表8～10。

表8 蒜氨酸抑菌圈直径/mm

表9 大蒜辣素抑菌圈直径/mm

表10 大蒜粉抑菌圈直径/mm

3 讨论

人体肠道菌群中双歧杆菌、乳杆菌是有益菌的代表，通过降低肠道内环境的pH值、抑制有害菌增殖而发挥作用[5]。产气荚膜梭菌是致病菌，能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，引起气性坏疽[6]。肠杆菌在相当长的一段时间内被认为是非致病菌，直到20世纪中叶才认识到一些特殊的肠杆菌对人和动物有致病性，常引起严重腹泻和败血症[7]。肠球菌是人类和动物肠道正常菌群的一部分，以往被认为是低毒性的微生物，很少引起致命的感染。近十多年来，肠球菌引起严重感染，并有较高病死率的报道不断增多[8]。产气荚膜梭菌、双歧杆菌、乳酸菌、肠球菌和肠杆菌是肠道菌群中较为重要的细菌种类。因此本实验选用这5种代表菌作为评价肠道菌群变化指标。

本实验给予小鼠蒜氨酸、大蒜辣素和大蒜粉30天，小鼠体重随灌胃时间延长而下降，初步推测大蒜及其提取物有减肥功效，后续将检测小鼠血糖、血脂等指标。灌胃后与对照组比较、或与灌胃前自身对照比较，发现肠道内乳杆菌、双歧杆菌数量明显升高，产气荚膜梭菌明显下降，肠球菌、肠杆菌数量无变化，说明大蒜提取物具有升高有益菌、抑制有害菌生长，能够优化肠道菌群结构，对肠道菌群具有有益的调节作用。通过比较低、中、高剂量蒜氨酸对肠道5种菌的调节作用，发现不同浓度的蒜氨酸对肠道菌群作用无明显差别，大蒜辣素和大蒜粉对肠道菌群的作用也同样无呈现出剂量依赖性。均选取高剂量组的蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉比较对肠道菌群的益生作用强弱，发现三种受试物对肠道菌群的益生作用无明显差异。说明不同浓度的蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉调节肠道菌群作用强弱无明显差别。

体内实验与体外抑菌实验结果比较，大蒜辣素、大蒜粉对肠杆菌、乳杆菌的体外抑菌作用与体内实验结果相反；蒜氨酸、大蒜辣素及大蒜粉对肠球菌的体外抑菌作用与体内实验结果相反。分析原因有可能是蒜氨酸、大蒜辣素及大蒜粉在体内生成代谢产物，造成体内体外实验结果差异。肠球菌、肠杆菌是条件致病菌，在健康小鼠体内数量稳定，只有在病理状况下，肠球菌、肠杆菌才会大量繁殖。体外实验将肠球菌、肠杆菌在培养皿上大量繁殖，相当于模拟了病理条件下肠球菌、肠杆菌的生长状况，体内实验与体外实验的条件不一致，导致实验结果不一致。说明了蒜氨酸、大蒜辣素及大蒜粉在病理条件下对肠球菌、肠杆菌有抑菌作用，在正常条件下，对肠球菌、肠杆菌无抑菌作用。大蒜辣素及大蒜粉对乳杆菌在体外有较强的抑菌作用，而在体内使乳杆菌数量增加，可能是大蒜辣素及大蒜粉在体内使致病菌产气荚膜梭菌数量降低，导致有益菌乳杆菌数量增加，有益菌双歧杆菌数量增加也会促进乳杆菌增殖。综合体内体外实验结果，蒜氨酸、大蒜辣素、大蒜粉对肠道菌群具有有益的调节作用。