儿咳灵糖浆对支气管哮喘模型小鼠Caspase-3，TNF-α表达的影响

邹 月,赵海南，刘丹丹，刘泽林，王 伟，姜星屹

（1廊坊市人民医院药学部；2北京中医药大学东方学院；廊坊市人民医院3全医学科，4感染科，河北 廊坊 065000）

支气管哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的一种常见慢性气道炎症，目前全球约有3亿支气管哮喘患者，我国支气管患者约3千万，随着全球工业化的高速发展，支气管哮喘的发病率逐年升高，已经成为严重影响人类健康的因素之一[1]。支气管哮喘病因复杂，可分为致病因素和诱发因素两大类[2]。临床上有多种治疗支气管哮喘的药物，如糖皮质激素类药物、β2受体激动剂、茶碱类等，但这些药物多具有毒副作用[3]。氧化应激是患者术后出现的不良反应，在治疗过程可介导多种炎症因子表达升高，加重疾病导致肺部纤维化[4]。TNF-α（肿瘤坏死因子-α）具有调控细胞凋亡的作用，由巨噬细胞等分泌，过表达的TNF-α可引起恶病质，TNF-α还具有促进炎症因子发展的作用，在机体受到损伤时，增加机体炎症水平[5]。caspase-3是一种蛋白酶，与细胞凋亡相关，caspase-3表达活性能够改变细胞生物学行为，当外源性调节caspase-3活性时具有激活细胞凋亡信号通路能够分泌大量炎症因子，造成严重炎症反应[6]。儿咳灵糖浆是连云港市中医院院内制剂(批准文号：苏药制字Z04000017)，由15味中药材配伍制成，具有清肺化痰、止咳平喘功效。本研究采用支气管哮喘模型小鼠，探究儿咳灵糖浆对支气管哮喘的作用机制，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器图像采集及图像分析系统（美国Bio-Rad公司）；吸入雾化器（德国Pari公司）；酶标分析仪（上海信裕生物科技有限公司）；高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；FlexiWash全自动蛋白质免疫印迹系统（上海环亚生物科技有限公司）。

1.2 试药儿咳灵糖浆是连云港市中医院院内制剂(批准文号:苏药制字Z04000017)。苏木素-伊红试剂盒（上海吉至生化科技有限公司，AG1120）；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（武汉博士德生物科技有限 公 司，EK1578）；Caspase-3抗体（美 国PLlab，PL0403200）；TNF-α抗体（美国PLlab，PL0403040）；山羊抗兔IgG二抗（英国Abcam，ab150077）；DAB染色剂及稀释液（上海碧云天生物科技有限公司，P0203），其他试剂为国产分析纯。

1.3 动物50只健康SPF级Sprague-Dawley小鼠购自广东省医学实验动物中心，6～8周龄雌雄参半，体质量（275±25）g，温度22℃，相对湿度50%～65%，自由饮水摄食，适应性饲养7 d。

2 方法

2.1 动物模型构建及分组建模方法：称取0.1 g OVA和2 g Al（OH）3置于100mL生理盐水中配成致敏液，于第1天给小鼠腹腔注射1 mL致敏液、第8天再注射1 mL致敏液重复致敏，14 d后用含2%OVA的生理盐水超声雾化器对小鼠进行每天喷射激发，到第22天开始隔天激发，每次喷射时间为30 min，3次/周持续激发6周后，小鼠如出现咳嗽、呼吸加速等症状视为建模成功。将建模成功的小鼠分为5组，分别为正常对照组、模型组、儿咳灵糖浆高（0.5 mL/kg）、低（0.1 mL/kg）剂量组、地塞米松组（0.01 mL/kg）。儿咳灵糖浆高、低剂量组分别以0.5 mL/kg和0.1 mL/kg的儿咳灵糖浆灌胃，地塞米松组以0.01 mL/kg地塞米松灌胃，对照组小鼠灌胃同体积的0.9%氯化钠溶液，每天1次，共8周。末次灌胃后，1%戊巴比妥钠麻醉后麻醉，甲醛心脏灌注，颈部脱臼安乐死后取肺，甲醛固定后，切成4 mm肺组织片备用。

2.2 肺组织HE染色和天狼星红染色观察取各组小鼠肺组织用4%多聚甲醛固定24 h后常规石蜡包埋、切片，切片厚度大约为5～6μm，用苏木素染液进行HE染色，中性树胶封片后，用光学显微镜进行组织病理学观察。染色液染色60 min，蒸馏水洗去浮色，中性树胶封片,显微镜下观察病理变化。

2.3 ELISA检测血清炎症因子蛋白表达各组小鼠取血3 mL，3 500～4 000 r/mim离心10 min，分离得到血清。按ELISA试剂盒说明书操作测定血清中IFNγ、IL-12、IL-6和TNF-α表达水平。

2.4 western-blot检测组织中蛋白表达取各组小鼠肺组织加入0.125%胰蛋白裂解液，剪碎研磨，低速离心机运转4 000 r/min离心10 min，取得上清液，血清样品中加入样孔。进行电泳，PVDF膜TBS浸泡10min，反复用PBS缓冲液冲洗，5 min/次，分别加入1抗，GAPDH抗体(1∶500)、过氧化物酶标记二抗（1∶2 000），分别杂交，PBS冲洗，后将膜浸入ECL工作液，检测Caspase-3和TNF-α蛋白浓度，获取图象。

2.5 统计学处理采用SPSS17.0统计学软件分析，计量资料以均数标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠肺组织HE染色结果与正常对照组相比，模型组细支气管管腔、肺泡腔内可见渗出液、脱落的上皮细胞等，远端肺泡可见局部肺不张及周围肺大泡，且肺间质明显增厚，炎细胞浸润明显，而与模型组组比较，其余组别症状明显减少，部分肺间质的组织结构趋向正常，部分肺泡轻度扩张，见图1。

图1 小鼠肺组织HE染色图

3.2 小鼠肺组织天狼星红染色观察正常对照组无纤维化现象，模型组肺部发生纤维化，发现支气管附近有大量炎症，肺泡发生损伤，其余组与之相比肺泡损伤较小，未出现膨胀。经过8周的药物干预，高剂量组纤维化已基本恢复至正常，见图2。

图2 各组小鼠肺组织天狼星红染色

3.3 各组小鼠肺组织平滑肌和支气管壁厚度比较与正常对照组相比，模型组支气管厚度和平滑肌厚度均增高，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，低剂量组和高剂量组支气管厚度和平滑肌厚度均降低，差异有统计学意义（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。地塞米松组和高剂量组的支气管厚度、平滑肌厚度比较无统计学差异（P>0.05），见表1。

表1 各组小鼠支气管壁和平滑肌增厚情况

3.4 小鼠血清中IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表达水平比较与正常对照组相比，模型组小鼠血清中IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表达水平上升，差异有统计学意义（P<0.05）。相比与模型组，低剂量组和高剂量组血清IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表达水平均下降，差异有统计学意义（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。地塞米松组和高剂量组上述指标比较无统计学差异（P>0.05），见表2。

表2 各组小鼠血清中IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表达水平比较/（pg/mL）

3.5 小鼠肺组织中Caspase-3、TNF-a蛋白表达与正常对照组相比，模型组肺组织中Caspase-3、TNF-α蛋白表达水平均上升，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，低剂量组和高剂量组Caspase-3、TNF-α蛋白表达水平均下降，差异有统计学意义（P<0.05），且高剂量组低于低剂量组，差异有统计学意义（P<0.05）。地塞米松组和高剂量组上述指标比较无统计学差异（P>0.05），见表3。

表3 各组小鼠肺组织内Caspase-3、TNF-a蛋白表达

4 讨论

本实验中，低、高剂量组的小鼠气道壁及平滑肌厚度明显降低，同时小鼠气道上皮的炎性损伤也明显减少；通过对组织的气道壁和平滑肌厚度检测发现，低、高剂量儿咳灵糖浆组和模型组小鼠相比，均能够显著抑制肺组织的气道壁和平滑肌增厚。研究证实，儿咳灵糖浆能够提高支气管疾病治疗效果，能增加肺部功能[7-9]。

免疫炎症损伤是支气管哮喘发生和发展的重要机制[10]。TNF-α、IL-6及IL-2属于常见的炎性因子其表达水平上调后能够增加炎症级联效应反应，增加机体损伤。本研究显示，儿咳灵糖浆可以明显改善支气管哮喘小鼠血清IFN-γ、IL-12、IL-6和TNF-α表达水平，说明该药能够改善免疫炎症损伤。目前，已有文献证实，儿咳灵糖浆能够显著降低肺部感染的炎症因子，而增加临床疗效[11]。

TNF-α调节炎症的主要因子，对哮喘致病机理中的NF-KB信号进行活化，并通过该信号对特定的细胞因子进行介导，多种细胞因子对哮喘患者的肺组织中大量浸润。TNF-α还可以形成一种自身免疫炎症反应，增加白介素指标升高，加重肺纤维化形成[10]。研究表示，对支气管哮喘小鼠沉默TNF-α受体可缓解肺损伤，说明TNF-α是介导肺损伤的一个关键因子[12]。有研究发现，儿咳灵糖浆其可能是通过抑制神经氨酸酶、细菌内毒素等与细胞凋亡相关因子的产生，从而进一步抑制血管渗漏及微循环血栓形成，最终达到抑制病理损伤的目的[13-14]。Caspase的启动蛋白酶是Caspase-3，Caspase-3表达水平与线粒体凋亡有关，在肺组织中Caspase-3降低，线粒体凋亡功能降低，当出现炎症损伤时，表达升高，加快肺细胞凋亡。本研究中，儿咳灵糖浆可以明显改善支气管哮喘小鼠肺组织中Caspase-3、TNF-α表达水平，提示。儿咳灵糖浆可能通过抗凋亡和改善炎症损伤而发挥作用。

综上所述，儿咳灵糖浆给药能有效降低肺组织的损伤以及Caspase-3和TNF-α的表达，阻止肺部气道壁和平滑肌的增厚，改善模型小鼠的哮喘症状，从而发挥保护作用。