ZNF568基因表达联合DNA甲基化分析与食管癌预后的关联

刘双，林征，俞凯莉，陈辉林，饶雯清，胡志坚

（1.福建医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学系，福州 350122；2.泉州市安溪县医院放疗科，福建 泉州 352400）

我国是食管癌高发地区，2017 年《国家癌症中 心最新研究报告》报道，食管癌发病率为14.09/10万，居我国肿瘤发病第五位［1］。尽管治疗技术在不断改进［2］，但患者总体预后仍然较差［3］。锌指蛋白（zinc finger protein，ZNF）是最大的DNA结合蛋白家族，ZNF DNA结合域通常与核酸酶或其他效应蛋白融合介导表观遗传反应［4］，调节基因的表达，进而影响肿瘤的发生、发展。研究［5］发现，ZNF568基因低表达与胃癌不良预后相关，可作为判断肿瘤预后的标志物。然而，目前尚无ZNF568基因表达联合DNA甲基化与食管癌预后的关联研究。因此，本研究通过联合分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌预后的关联，为食管癌预后的预测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 TCGA数据库数据下载与预处理

通过TCGA数据库官网（https：//portal.gdc.cancer.gov），下载食管癌DNA甲基化数据、基因表达数据与临床数据，使用Perl脚本进行注释，并对注释后的数据进行预处理。

1.2 癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）数据库数据下载

通过CCLE数据库官网（https：//portals.broadinstitute.org/ccle/），下载食管癌ZNF568基因表达和DNA甲基化数据，验证ZNF568基因表达和DNA甲基化之间的关联。

1.3 统计学分析

采用R软件中的limma包对DNA甲基化数据进行芯片归一化处理，并对食管癌癌组织与癌旁组织进行DNA甲基化差异分析；使用edgeR包分析食管癌癌组织与癌旁组织ZNF568基因的表达情况；筛选条件为错误发现率（false discovery rate，FDR ）=0.05，fold change=1。ZNF568基因表达水平与DNA甲基化的关联分析使用Spearman 秩相关。采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，通过 log-rank 检验进行生存曲线的比较；使用Cox回归模型对ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌患者预后的关联进行单因素和多因素分析，计算风险比（hazard ratio，HR）和95%可信区间（confidence interval，CI）。建立预测Cox回归分析模型列线图，内部验证采用Bootstrap法，采用一致性指数（C指数）评价模型准确度。本研究使用R软件（3.5.3）进行统计分析，显著性检验为双侧检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 TCGA数据库食管癌癌组织和癌旁组织ZNF568基因表达和DNA甲基化差异分析

采用R软件中的limma包对186例食管癌癌组织和16例癌旁组织进行ZNF568DNA甲基化差异分析，发现ZNF568基因在癌组织中的甲基化水平高于癌旁组织（FDR＜0.001）；采用edgeR包对159例食管癌癌组织与10例癌旁组织进行ZNF568基因表达差异分析，发现ZNF568基因在癌旁组织中的表达水平高于癌组织（FDR ＜0.001）。见图1。

图1 TCGA数据库中食管癌癌组织和癌旁组织ZNF568基因表达和DNA甲基化Fig.1 ZNF568 gene expression and DNA methylation in esophageal cancerous and paracancerous tissues in the Cancer Genome Atlas database

2.2 DNA甲基化与基因表达水平的关联分析

对159例癌组织中ZNF568基因表达水平与DNA甲基化进行关联分析，结果发现，ZNF568基因表达水平与DNA甲基化存在负相关（P＜0.001），见图2。

图2 TCGA数据库中ZNF568基因表达水平与DNA甲基化的关联分析Fig.2 Correlation analysis of ZNF568 gene expression level and DNA methylation in TCGA database

2.3 CCLE数据库验证ZNF568基因表达水平与DNA甲基化的关联性

下载CCLE数据库中食管癌细胞系（17种食管癌细胞株）ZNF568基因表达、DNA甲基化数据，Spearman秩相关分析发现，ZNF568基因表达水平与DNA甲基化存在负相关（P=0.002），见图3。

图3 CCLE 数据库中ZNF568基因表达水平与DNA甲基化的关联分析Fig.3 Correlation analysis of ZNF568 gene expression level and DNA methylation in the Cancer Cell Line Encyclopedia database

2.4 联合分析ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌预后的关联

Kaplan-Meier法绘制的生存曲线和log-rank检验分析发现，ZNF568基因表达和DNA甲基化与食管癌生存无关联（P=0.059，图4）。调整性别、年龄、分化程度和TNM分期后，多因素Cox回归分析发现，ZNF568基因表达水平和DNA甲基化联合分析与食管癌预后存在关联，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化能改善食管癌预后（HR=0.70，95%CI：0.51～0.96，P=0.043），见表1。

图4 ZNF568基因表达水平和DNA甲基化联合分析与食管预后的生存曲线Fig.4 Kaplan-Meier overall survival curves according to combined ZNF568 gene expression and DNA methylation

表1 ZNF568基因表达水平和DNA甲基化联合分析与食管癌预后的相关性Tab.1 Analyses of combined ZNF568 gene expression and DNA methylaiton in relation to overall survival

2.5 构建ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析的列线图

使用多因素Cox回归分析的变量构建列线图（图5），ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析能很好地预测食管癌预后，C指数为0.697（95%CI：0.543～0.851）。

图5 ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析预测食管癌总生存的列线图Fig.5 Nomogram for overall survival according to combined ZNF568 gene expression and DNA methylation

3 讨论

TCGA是一个国际项目，收集了高质量的肿瘤和正常组织样本，并在多个高通量平台上进行了分子分析，收录了各种人类肿瘤的基因组变异、mRNA表达、DNA甲基化、临床信息等数据［6］。在大数据时代的背景下，生物信息学分析利用如TCGA数据库等高通量数据库，在肿瘤的全面研究中发挥了重要作用。本研究通过TCGA数据库联合分析食管癌DNA甲基化和基因表达的数据发现，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化能改善食管癌预后，使用ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析构建的列线图能很好地预测食管癌预后，C指数为0.697，说明ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析可作为预测食管癌预后的标志物。

ZNF是最大的DNA结合蛋白家族，可作为真核生物中的转录因子，并通过特征性锌指结构域选择性结合靶基因启动子中的特定DNA序列［7-8］。ZNF DNA结合域通常与核酸酶或其他效应蛋白融合介导表观遗传反应［4］。不同肿瘤的研究［9］已经证明宿主DNA高甲基化导致肿瘤抑制基因沉默，而低甲基化区域与癌基因的表达增加。目前，尚无ZNF568基因表达联合DNA甲基化与食管癌预后的研究，但ZNF家族基因DNA甲基化和基因表达与肿瘤预后已有研究报道。使用TCGA数据库，ZHANG等［10］发现，ZNF726基因低表达能改善结肠癌的预后（HR=0.55，95%CI：0.34～0.89），使用CCLE数据库进一步评估结肠癌细胞中ZNF726基因表达，发现甲基化的调节对ZNF726基因起重要作用。此外，在肺鳞状细胞癌的研究［11］中发现，ZNF454基因是肺鳞状细胞癌预后相关的甲基化驱动基因，通过联合分析ZNF454基因表达和DNA甲基化的数据，发现ZNF454基因低表达、DNA高甲基化能改善肺鳞状细胞癌的预后（P＜0.05）；对肺鳞状细胞癌ZNF454甲基化驱动基因进行通路分析，发现ZNF454基因主要作用的途径为“通用转录”“ RNA聚合酶Ⅱ转录”和“基因表达”，提示ZNF454基因表达和DNA高甲基化存在关联。以上的研究说明ZNF家族基因甲基化与肿瘤预后存在关联，可作为判断肿瘤预后的标志物。

目前，仅有一篇研究报道了ZNF568基因表达与胃癌的关联，WANG等［5］使用TCGA数据库发现，ZNF568基因等5个基因是胃癌的突变基因，ZNF568基因低表达与胃癌预后存在关联（P＜0.05），ZNF568基因表达可作为预测胃癌预后的标志物。然而，目前尚无ZNF568基因表达和DNA甲基化与肿瘤预后的相关研究。本研究通过使用TCGA数据库，联合分析ZNF568基因表达和DNA甲基化发现，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化与食管癌预后相关；构建ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析的列线图，结果显示，使用该基因能很好地预测食管癌的预后（C指数为0.697），说明ZNF568基因表达和DNA甲基化联合分析可用于预测食管癌预后。与经典遗传学改变不同，甲基化修饰的过程动态可逆［12］，因此，抑制ZNF568DNA甲基化作用可使上调ZNF568基因重新表达，这一特性也为食管癌的临床治疗提供新的思路。

综上所述，ZNF568基因高表达、DNA低甲基化与食管癌预后相关，检测食管癌ZNF568基因表达水平和DNA甲基化程度有助于判断食管癌的预后。