薯蓣皂苷通过调节人髓核细胞TLR4/NF-κB信号通路抑制IL-1β诱导的分解代谢和凋亡

高维松，王隆辉，顾运涛，赵 海，齐 昊，吴昌新

(海南医学院第二附属医院骨科，海南 海口570102)

椎间盘是脊柱结构的重要组成部分，其可吸收、减轻和传递加载在脊柱上的负荷，增加脊柱的活动性[1]。然而，在衰老、外伤、肥胖、机械应力的作用下，椎间盘微环境会出现变化，引起椎间盘细胞功能低下及其结构的破坏，导致椎间盘退变(intervertebral disc degeneration，IDD)相关疾病，如椎间盘源性腰痛和椎间盘突出症[2-3]。而关于IDD的具体病理生理机制目前尚不清楚，仍需要进一步研究以制订有效的防治策略。

髓核(nucleus pulposus，NP)细胞存在于含有Ⅱ型胶原和蛋白多糖的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中，后者的保水能力是抵抗脊柱压缩轴向力的必要条件[4-5]。在健康的NP组织中，NP细胞维持ECM的代谢平衡，包括aggrecan和胶原，其功能状态以及数量直接关系到ECM的代谢平衡[6]。白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)已被证明能够通过触发多种炎症信号通路，如激活核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和有丝分裂原蛋白激酶通路，从而增强促炎因子的表达，扰乱ECM代谢的平衡，促进ECM的分解代谢[7]。故抑制NP细胞炎症反应以及相应的炎症通路是一个很有前景的治疗IDD的策略。

薯蓣皂苷(dioscin,Dio)是一种从草药中提取的天然甾体皂苷[8]。目前大量研究表明，Dio在各种疾病中具有抗炎、抗凋亡和抗氧化的作用[9-11]，其可通过减少促凋亡蛋白的表达来抑制细胞凋亡，从而减轻二甲基亚硝胺诱导的急性肝损伤[12]；也可通过调节细胞凋亡、自噬和DNA损伤抑制肝癌[13]；还可通过激活SIRT1/AMPK信号通路调节脂质代谢，预防非酒精性脂肪肝[14]。还有研究报道，Dio可通过抑制Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)信号传导减轻脑缺血/再灌注损伤[15]。故本研究认为Dio可能对IDD有一定的保护作用。目前，关于Dio对IDD的潜在影响还未见相关报道。因此，本研究探讨Dio对IL-1β诱导的人NP细胞的作用及潜在机制，以期为临床治疗IDD提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和抗体

Dio(纯度大于99%)购自上海陶托生化技术有限公司，IL-1β购自美国RD公司，一抗(Ⅱ型胶原、TLR4、NF-κB p65、IκBα和β-actin)购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 原代人NP细胞培养及处理

人体NP组织收集符合海南医学院第二附属医院伦理委员会的指导原则，并取得患者或其亲属对获取椎间盘组织的知情同意书。人NP细胞培养参考文献[16]，将培养后的第2～3代NP细胞用于后续实验。将人NP细胞分为control组、IL-1β组、IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组，IL-1β组、IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组分别用10 ng·mL-1IL-1β、100 ng·mL-1Dio和500 ng·mL-1Dio处理1 d。

1.3 NP细胞活力检测

将NP细胞接种于96孔板(每孔5×103～6×103个细胞)中培养1 d，用不同浓度的Dio和IL-1β(10 ng·mL-1)孵育。孵育1 d后，按照CCK-8说明书要求，每孔加入CCK-8溶液(10 μL)2 h，用分光光度计测定样品在450 nm波长处的吸光度。

1.4 免疫荧光分析

Ⅱ型胶原染色时，将NP细胞接种于玻片上培养。药物处理后，用4%多聚甲醛处理固定15 min，然后用0.5% Triton X-100处理10 min，随后在含5% BSA的封闭缓冲液中孵育30 min。在4 ℃下用一抗(抗Ⅱ型胶原)处理过夜，次日用对应的二抗处理1 h。漂洗后用DAPI处理10 min，然后用抗荧光猝灭剂封片。用激光共聚焦显微镜对免疫染色样品进行拍摄。

1.5 Western blot

药物处理后，细胞样品添加细胞裂解液以提取细胞蛋白，同时用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，并配备标准蛋白上样品。上样品(40 μg)加入SDS凝胶进行电泳(100 V)，并通过电转膜(300 mA，90 min)转移到PVDF膜上。利用5%脱脂牛奶封闭阻断非特异性抗原结合位点后，样本在4 ℃下用一抗(1∶1 000)孵育过夜，在37 ℃下用二抗(1∶10 000)孵育60 min。使用ChemiDoc XRS+成像系统对条带进行曝光和检测。

1.6 定量RT-PCR

用TRIzol法提取NP细胞总mRNA。用RNA样品、Prime-Script RT-PCR试剂盒反转录合成cDNAs。用SYBR-Green-PCR试剂盒扩增cDNAs(变性、退火、延伸)。用2-ddCt法定量mRNA表达，计算其与β-actin基因的相对表达水平。

1.7 NO与PGE2表达测定

用Griess法测定NO浓度。Dio预处理2 h后，用IL-1β(10 ng·mL-1)刺激软骨细胞24 h，用ELISA试剂盒检测培养液中前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 Dio改善IL-1β刺激下人NP细胞活性

CCK-8法结果显示，Dio在1～1 000 ng·mL-1剂量下对NP细胞活力没有影响(图1a)。NP细胞用IL-1β和不同浓度的Dio(1、10、100、500 ng·mL-1)处理1 d后显示，Dio对IL-1β刺激的NP细胞活力有剂量依赖性保护作用(图1b)。

a:CCK-8法检测不同浓度Dio对人NP细胞的毒性作用;b:Dio对IL-1β刺激下人NP细胞的活性分析 *:与control组相比,P<0.05；#:与IL-1β组相比,P<0.05

2.2 Dio降低IL-1β刺激下的人NP细胞PGE2和NO生成

与control组相比，IL-1β组NO和PGE2表达显著增加(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组PGE2和NO表达受到抑制(P<0.05)，见图2。

a:ELISA法测定PGE2水平;b:Griess法测定培养基中NO的含量

2.3 Dio抑制IL-1β刺激下人NP细胞iNOS和COX-2水平

与control组相比，IL-1β组COX-2和iNOS的表达显著增加(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组COX-2和iNOS mRNA水平降低(P<0.05)，见图3。

a:RT-PCR检测iNOS mRNA的表达;b:RT-PCR检测COX-2 mRNA的表达 *:与control组相比，P<0.05;#:与IL-1β组相比，P<0.05

2.4 Dio抑制IL-1β刺激下人NP细胞的ECM降解

与control组相比，IL-1β组collagenⅡ和aggrecan的水平降低(P<0.05)，见图4a、b；与IL-1β组相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组collagenⅡ和aggrecan mRNA水平较高。collagenⅡ免疫荧光染色结果与RT-PCR检测结果一致(图4c)。

a:RT-PCR检测collagenⅡ的相对mRNA水平;b:aggrecan的相对mRNA水平;c:collagenⅡ蛋白(绿色)和细胞核(蓝色)的免疫荧光染色 *:与control组相比,P<0.05；#:与IL-1β组相比,P<0.05

2.5 Dio抑制IL-1β刺激下人NP细胞的炎症因子以及NF-κB信号通路

RT-PCR结果显示，与control组相比，IL-1β组IL-6和TNF-α的表达增加(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组IL-6和TNF-α的表达降低(P<0.05)，见图5a、b。与control组相比，IL-1β组TLR4水平显著上调(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组TLR4水平下调(P<0.05)，见图5c、d。与control组相比，IL-1β组NF-κB p65蛋白表达增加(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.05)，见图5c、e。与control组相比，IL-1β组诱导人NP细胞IκBα降解(P<0.05)；与IL-1β组相比，IL-1β+Dio 100 ng·mL-1组和IL-1β+Dio 500 ng·mL-1组人NP细胞IκBα降解被显著抑制(P<0.05)，见图5c、f。

a:RT-PCR检测IL-6的相对mRNA水平;b:RT-PCR检测TNF-α的相对mRNA水平;c～f：Western blot检测TLR4、NF-κB p65和IκBα的相对mRNA水平 *：与control组相比，P<0.05；#：与IL-1β组相比，P<0.05

3 讨论

IDD是引起腰痛的主要原因之一[17]。衰老、代谢失衡、机械应激、炎症与IDD的发病有关[18-19]。然而，IDD的具体病理机制尚未完全阐明。椎间盘组织由中央NP组织、周围纤维环组织和软骨终板组成。健康的NP组织维持ECM的代谢平衡，包括aggrecan和胶原，后者保证NP正常的生物力学功能。有研究报道，NP在IDD早期表现出退行性表型，如ECM丢失、NP细胞数量减少等[1]。故探究IDD中NP退变的机制以及针对性地增加NP细胞的数量和改善其功能是治疗IDD的重要策略。

炎症在IDD中NP细胞凋亡以及功能低下的发生发展中起着关键作用[20]。炎症介质升高可能导致NP细胞凋亡以及ECM的降解[21]。在这些炎症介质中，IL-1β在IDD的发病机制中起着关键作用[22]。IL-1β可刺激NP细胞以及骨关节炎中的软骨细胞诱导其他炎症介质的释放，包括PGE2和NO，后者可通过触发MMPs合成并抑制IDD中NP细胞的基质合成而被证明是分解代谢因子[23-24]。PGE2和NO的产生可导致IDD的发展[25]。NO被广泛认为是能够触发MMP分泌和激活的炎性介质，在IDD病理过程中，NO也可以抑制aggrecan和Ⅱ型胶原的产生。PGE2是炎症和疼痛的主要介质，可在IDD发病过程中增强ECM降解并抑制NP细胞增殖。先前的研究表明，抑制包括NO和PGE2在内的炎症介质的产生会减弱IDD的进展[26]。本研究结果显示，Dio可显著抑制IL-1β刺激下的NP细胞COX-2和iNOS的mRNA水平以及PGE2和NO的生成，同时Dio对IL-1β诱导的ECM的分解代谢也有显著的抑制作用，表明Dio可通过抑制IL-1β介导的炎性介质的表达，起到保护NP细胞功能的作用。

据报道，椎间盘NP组织的过度炎症反应与其分解代谢水平的增加密切相关[27-28]。因此，抑制炎症反应可能有助于预防NP细胞分解代谢和改善IDD。TLR信号通路的激活被证明可以增强炎症介质(如TNF-α、IL-1和IL-6)的表达，从而促进炎症反应[29]。TLR4在骨关节炎以及IDD过程中过表达，在退变过程中起重要作用[30]。同样，体内外研究表明，促进炎症因子(iNOS以及COX-2等)的释放可减少NP细胞ECM的含量，后者可通过增加TLR4的表达来实现[31-32]。配体与TLR4结合触发信号级联，促进NF-κB信号激活，从而增加炎性细胞因子和降解酶的表达。LPS作为一种TLR4的特异性配体，可通过激活TLR4信号通路，促进小鼠和人关节软骨细胞collagenⅡ和aggrecan的降解[33]。在相关模型中，抑制TLR4可间接抑制NF-κB通路，减少iNOS以及COX-2的转录，从而减少NO、PGE2、IL-6和TNF-α的释放[34]。IL-1β可促进NP细胞的炎症反应和基质降解酶的释放[35]。先前的研究表明，IL-1β在NP细胞中显著上调，提示IL-1β在IDD过程中可能起关键作用[7]。在本研究中，IL-1β可显著提高人NP细胞TLR4水平，激活NF-κB信号通路。IL-1β通过上调基质降解酶促进ECM蛋白降解。然而，Dio可减弱IL-1β刺激的人NP细胞TLR4/NF-κB通路的激活，逆转细胞外基质蛋白的降解。研究表明，Dio对多种疾病具有抗炎作用，如Dio可通过调节TLR4/MyD88信号通路，显著抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB p65的释放，从而减轻炎症反应[12]，其还可通过抑制NF-κB途径抑制TNF-α激活的血管细胞黏附分子-1和内皮脂肪酶的表达[36]。本研究结果也显示，Dio可抑制IL-1β触发的炎症因子(TNF-α、IL-6、NO和PGE2)的释放，该效应可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来实现。

综上，本研究显示TLR4/NF-κB信号转导可能与Dio抑制IL-β激活的NP细胞炎症反应和分解代谢有关，Dio可抑制IL-1β触发的炎症因子(TNF-α、IL-6、NO和PGE2)的释放。本研究结果为Dio的药理作用及机制提供了初步证据，为临床治疗IDD提供了新的可能。