过表达miR-449a对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜的保护作用及机制研究

卢 静，李建红，彭 巍

(1.成都市第五人民医院神经内科，四川 成都 611130；2.成都市第五人民医院普外科，四川 成都 611130)

1 材料与方法

1.1 材料

研究对象：SD健康雄性大鼠(由江苏大学动物实验中心提供)40只，体质量210～230 g，平均(219.00±19.95)g，放在温度18～26 ℃、湿度45%～55%的干净笼子中喂养，饮水和新鲜干燥的饲料均进行消毒之后供其自由食用1周。

主要试剂：兔抗小鼠免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)抗体(BD公司)；兔抗大鼠白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)、白细胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抗体(Dako公司)；大鼠鼠抗兔紧密连接蛋白Claudin-1、Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)抗体(Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组 随机选取10只大鼠作为对照组，不做任何处理。其余30只大鼠进行溃疡性结肠炎建模，造模前所有大鼠禁食不禁水36 h，称重后使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内注射麻醉，灌胃针用润滑油涂抹后，从大鼠肛门口插入约8 cm左右，将1 mL混合液一次性注入，再注入0.5 mL空气，捏紧肛门，将大鼠臀部倾斜朝上约15 min，使其自然苏醒，注意保暖。大鼠出现浓血便、体型消瘦、少食懒动、眯眼、反应迟钝等生理表现时表明建模成功。最终25只大鼠建模成功，将其随机分为模型组9只，抑制miR-449a组8只，过表达miR-449a组8只。将所有大鼠放置于玻璃麻醉箱内麻醉，将含4%七氟醚棉球的小烧杯(50 mL)放入麻醉箱内，待动物出现呼吸变慢、四肢紧张度明显降低、角膜反射迟钝、皮肤痛觉消失等表现，则表明大鼠进入到麻醉期。麻醉之后抑制miR-449a组大鼠尾部静脉注射30 mg/kg antagomiR-449a进行干预，过表达miR-449a组大鼠尾部静脉注射30 mg/kg agomiR-449a进行干预，对照组及模型组大鼠尾部静脉注射等量生理盐水。

1.2.2 标本采集 药物干预24 h后，取各组大鼠尾部静脉血2 mL,2 000 r/min离心15 min后分离上清液，置于-80 ℃保存待检。

1.2.3 HE染色 对各组大鼠进行全身麻醉处理后，采用断头法分批处死所有大鼠，获取肠黏膜组织，液氮冷冻后常规脱水、透明、石蜡包埋，间距5 mm作连续切片。将切片按顺序置入不同浓度酒精中。使用苏木精染色15 min后清洗3次，使用盐酸酒精分化处理30 s，清洗之后使用1%伊红染色，封片后使用显微镜进行观察。

1.2.4 酶联免疫吸附法检测炎症因子相关指标 取血清5 mL，离心处理后于-80 ℃保存。采用酶联免疫吸附法对IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α表达量进行检测。使用包被缓冲液将特异性抗体球蛋白稀释至最为合适的浓度(1～10 μg/mL)；随后在每个凹孔内增加0.3 mL，放置在0 ℃保存过夜；次日移去包被缓冲液之后使用洗涤缓冲液每5 min对凹孔进行冲洗，共冲洗3次，在每个凹孔内加入0.2 mL含抗原的标本，在37 ℃下作用2 h，随后使用洗涤缓冲液(含0.05%吐温-20)洗涤3次。加入0.2 mL抗体溶液(稀释缓冲液稀释过后的酶标记特异性抗体溶液)在37 ℃下作用2 h。PBS溶液重复洗涤3次。洗涤后在每个凹孔内加入0.2 mL底物溶液，于常温下作用30 min后在每个凹孔内加入2 mol/L H2SO4或者2 mol/L柠檬酸0.05 mL，使用酶标比色仪对IL-8、IL-17、IL-10、TNF-α水平进行评价。

1.2.5 免疫透射比浊法检测免疫球蛋白及环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)水平 准备3根试管并分别标记为标准管、测定管及空白管，均加入350 μL缓冲液，标准管中加入20 μL IgA、IgM、IgG、COX-2标准液，测定管中加入20 μL血清，空白管中加入20 μL蒸馏水，分别摇匀，常温静置5～10 min后使用分光光度计进行比色，在500 nm波长处以空白管调零，记录吸光度，计算IgA、IgM、IgG、COX-2水平。

1.2.6 免疫组织化学染色法检测Claudin-1、TLR4表达 对标本进行脱蜡、水化等处理之后，将其浸泡于0.01 mol/L、95 ℃的枸橼酸缓冲液中，并进行热修复，3% H2O2环境下培育10 min，滴入山羊血清，26 ℃环境中培养30 min，抽离封闭液，添加Claudin-1、TLR4一抗，将其置于5 ℃过夜培养，次日加入二抗，于37 ℃恒温箱中培养30 min，清洗后进行DAB显色、封片。

5）提高全社会水资源保护意识。拓宽公众参与和舆论监督渠道，充分利用媒体媒介的作用，加强水法、水资源保护条例、水污染防治法等法律法规的宣传力度，调动公众参与水资源保护的积极性和自觉性，鼓励举报违法排污行为，严厉查处污染和破坏水资源的不法行为。

1.2.7 Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白表达水平 取大鼠肠黏膜组织，加入裂解液裂解、匀浆、提取总蛋白，与缓冲液混合100 ℃煮沸5 min后电泳(120 V，3 h)。在90 V、4 ℃下将靶蛋白转移至NC膜上，转膜时间为90 min，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗(1∶300)，过夜孵育。加入二抗(1∶5 000)孵育2 h，显影、定影、冲洗、晾干，扫描胶片，采用Image J软件分析细胞凋亡相关蛋白p-p38、过氧化酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)表达，以β-actin为内参，目标蛋白水平=目标条带灰度值/β-actin条带灰度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织病理情况

如图1所示，对照组大鼠结肠黏膜上皮完整，杯状细胞隐窝较为完整。模型组大鼠结肠黏膜杯状细胞减少，损伤面积较大，隐窝变形，有炎性细胞浸润。抑制miR-449a组大鼠结肠黏膜杯状细胞减少，隐窝有一定的变形，炎性细胞浸润。过表达miR-449a组大鼠结肠黏膜未见明显的糜烂、损伤，炎性细胞浸润有所减少。

2.2 各组大鼠IL-8、IL-10、IL-17水平比较

与对照组相比，模型组、抑制miR-449a组大鼠IL-8、IL-17较高，IL-10较低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，抑制miR-449a组、过表达miR-449a组大鼠IL-8、IL-17较低，IL-10较高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与抑制miR-449a组相比，过表达miR-449a组大鼠IL-8、IL-17较低，IL-10较高，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

a:与对照组比较，P<0.05;b:与模型组比较，P<0.05；c:与抑制miR-449a组比较，P<0.05

2.3 各组小鼠免疫球蛋白水平比较

与对照组相比，模型组大鼠IgA、IgM、IgG均有所上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，抑制miR-449a组大鼠IgA、IgM、IgG均有所上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；与抑制miR-449a组相比，过表达miR-449a组大鼠IgA、IgM、IgG均有所下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

a:与对照组比较，P<0.05;b:与模型组比较，P<0.05；c:与抑制miR-449a组比较，P<0.05

2.4 各组大鼠TNF-α、COX-2水平比较

与对照组相比，模型组大鼠TNF-α、COX-2有所上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，抑制miR-449a组大鼠TNF-α、COX-2有所下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与抑制miR-449a组相比，过表达miR-449a组大鼠TNF-α、COX-2有所下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

a:与对照组比较，P<0.05;b:与模型组比较，P<0.05；c:与抑制miR-449a组比较，P<0.05

2.5 各组大鼠Claudin-1、TLR4水平比较

与对照组相比，模型组大鼠Claudin-1下降，TLR4上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，抑制miR-449a组大鼠Claudin-1上升，TLR4下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与抑制miR-449a组相比，过表达miR-449a组大鼠Claudin-1上升，TLR4下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图5、6。

a:与对照组比较，P<0.05;b:与模型组比较，P<0.05；c:与抑制miR-449a组比较，P<0.05

2.6 各组大鼠p-p38、PPARγ、NF-κB蛋白表达

与对照组相比，模型组大鼠PPARγ下降，p-p38、NF-κB上升，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，抑制miR-449a组大鼠PPARγ上升，p-p38、NF-κB下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与抑制miR-449a组相比，过表达miR-449a组大鼠PPARγ上升，p-p38、NF-κB下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图7、8。

图6 各组大鼠Claudin-1及TLR4表达免疫组化图片(×200)

a:与对照组比较，P<0.05;b:与模型组比较，P<0.05；c:与抑制miR-449a组比较，P<0.05

图8 各组大鼠p-p38、PPARγ、NF-κB蛋白表达Western blot图

3 讨论

溃疡性结肠炎的病因至今仍不明确，研究显示，心理因素对于疾病恶化具有重要的作用[9]。溃疡性结肠炎是一种自身免疫性疾病，其发病是由外源物引起的宿主反应、基因和免疫三者互相作用的结果[10-11]。溃疡性结肠炎的病变局限于大肠黏膜及黏膜下层，病变位置大多位于乙状结肠和直肠之间，也可以延伸到降结肠，最后可蔓延至整个直肠[12]。

趋化因子家族是一种由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白[12-13]，因其具有诱导附近反应细胞定向趋化的能力，而被命名为趋化细胞因子[14-15]。IL-8、IL-17、IL-10是临床常见的趋化因子，对其进行检测能够对机体趋化因子的水平进行较为准确的评价[16]。本研究结果显示，过表达miR-449a使IL-8、IL-17下降，IL-10上升，说明IL-8、IL-17、IL-10与溃疡性结肠炎有着密切的联系，过表达miR-449a可通过调节IL-8、IL-17、IL-10对溃疡性结肠炎起到一定的治疗效果。

免疫球蛋白是指具有抗体活性或化学结构，与抗体成分较为相似的球蛋白[17]，共分为5类，即IgG、IgA、IgM、免疫球蛋白D(immunoglobulin D，IgD)和免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)[18-19]。其中，IgA在血清中的含量仅次于IgG在黏膜组织内的含量[20]。IgM是分子量最大的免疫球蛋白，主要由脾和淋巴结中浆细胞分泌合成，在血清内无具体表达形式[21-22]。IgM具有强大的杀菌、激活补体、免疫调节和凝聚作用，也参与某些自身免疫病及超敏反应的病理过程。IgG主要分布于血清和组织液中，在人体血清中的含量最高，并且在血清中半衰期长[23-24]，是人体免疫反应最重要的物质基础，并且还是唯一能通过胎盘屏障的免疫球蛋白，对新生儿抗感染有着重要作用。本研究结果显示，过表达miR-449a能够使免疫球蛋白下降，说明过表达miR-449a可通过调节免疫球蛋白的表达改善机体免疫功能，增强机体免疫反应，起到治疗溃疡性结肠炎的作用。

肿瘤坏死因子分2种，即TNF-α和TNF-β，是迄今为止发现的直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一[25-26]。TNF-α是由单核—巨噬细胞分泌而成，能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性。COX有至少2种同工酶，COX-1与COX-2，其中COX-1称为固有性COX，COX-2称为诱生型COX[27]。COX-2是一种双功能酶，具有一定的环氧化酶和过氧化酶活性，是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶[28]。炎症损伤主要是由刺激单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等诱导触发炎症反应的关键因子COX-2合成导致。本研究结果显示，过表达miR-449a组大鼠TNF-α、COX-2下降，由此表明过表达miR-449a可有效抑制溃疡性结肠炎中炎症反应蔓延，减轻机体损伤，证实溃疡性结肠炎的发生与炎症反应相关。

miR-449a是miRNAs的一种，在正常情况下，miR-449a在肺、气管、睾丸中高表达，在宫颈、食道中亦有所表达。正常情况下miR-449a在机体组织的分化、成熟过程中有着重要的调节功能。PPARγ是PPARs超家族成员的一种亚型，是临床研究中被深入研究的亚型，有着复杂多样的生物学功能，能够参与肠道的运动。本研究结果显示，过表达miR-449a之后，大鼠体内p-p38下降，PPARγ上升，NF-κB下降，说明过表达miR-449a能够通过激活PPARγ，抑制p-p38/NF-κB通路，改善肠道运动，减少机体炎症反应对肠黏膜的损伤，起到修复结肠组织的作用。

Claudin-1表达于上皮细胞及神经周细胞中。有研究表示，Claudin-1能够减轻肠道炎症反应，促进结肠黏膜愈合，重建肠黏膜屏障的完整性[29]。TLR4是参与非特异性免疫的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[30]。本研究结果显示，过表达miR-449a组Claudin-1上升，TLR4下降，说明过表达miR-449a能够通过改善Claudin-1、TLR4来促进肠黏膜愈合，修复肠黏膜。

综上所述，过表达miR-449a能够通过调节p38-PPAPγ/NF-κB通路，有效抑制溃疡性结肠炎的炎症反应，减少炎症因子表达，对肠黏膜起着修复、保护作用。