SALL4高表达在食管鳞癌临床病理及预后判定中的意义

卢俊蓉 王惠文 何东风

食管癌(Esophageal cancer，EC)是全球排名第七的常见癌症，也是第六大癌症死亡原因，每年约有57.2万的新发病例以及50.9万的癌症死亡。食管癌的病理类型主要包括鳞癌(Squamous cell carcinoma)和腺癌(Adenocarcinoma)，在我国，食管癌的发病率居于所有恶性肿瘤的第四位，也是癌症死亡的主要原因之一[1-2]，诊治时的患者多数为中晚期病人，预后较差，5年生存率不足10%[3]。虽然食管癌的流行病学危险因素我们已经熟知，但是其发生的分子机制尚不清楚，阐明这些机制可能有助于识别新的治疗靶点。婆罗双树样基因4(Sal-like 4，SALL4)，编码一个C2H2锌指样转录因子，是果蝇同源异形基因spalt(sal)的哺乳动物同源体[4]，是维持胚胎干细胞多能性和自我更新的关键因素之一[5-6]。SALL4作为一个原癌基因，首次在白血病中被报道具有促癌作用，在人类急性髓系白血病中发现了SALL4的组成性表达，在转基因SALL4B小鼠中发现了急性髓系白血病。随后，SALL4的表达在各种类型的癌症中被报道，并被证实具有诊断价值[7-8]。以往国内外鲜有关于SALL4与食管癌发生发展关系的报道，本研究旨在探讨SALL4在食管鳞癌中的表达及其预后判定意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年7月—2011年11月哈尔滨医科大学附属肿瘤医院收治的食管癌患者90例进行回顾性分析，中位年龄52岁，年龄31～78岁。食管癌组织和相应的癌旁组织(指距病灶2 cm的切缘阴性的非肿瘤组织)[9-10]标本被纳入本研究中。所有的病例均经过病理学检查确诊为食管癌，病理类型为食管鳞癌，组织病理诊断以及评估系统为AJCC第八版分级系统。所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。在2010年7月—2011年11月期间，所有患者均接受了手术治疗，将围手术期死亡的患者从本研究中剔除。本研究经过哈尔滨医科大学附属肿瘤医院伦理委员会的审查批准。

1.2 主要试剂

兔抗人SALL4抗体(ab29112)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔抗体(ab205718)购自Abcam公司，IHC的S-P试剂盒和二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒均购自上海芯超生物科技有限公司。本实验应用S-P法进行免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)染色，详尽的实验流程遵从试剂说明书。

1.3 IHC测定食管鳞癌组织和癌旁组织中SALL4表达

将食管鳞癌组织和癌旁组织石蜡切片烤片2 h，经脱蜡水化，加入过氧化氢去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶活性，加入枸橼酸钠修复抗原，加入10%山羊血清孵育10 min封闭，加入一抗：兔抗人SALL4多克隆抗体(1∶200)过夜孵育，加入二抗：HRP标记的山羊抗兔抗体孵育1 h，加入DAB显色液显色1 min，苏木素复染、盐酸乙醇分化，脱水、透明、封片，显微镜下拍照观察。以已知正常食管鳞癌组织阳性切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照。结果判定，阴性(0分)，临界(1分)，轻度染色(2分)，中度(3分)，重度染色(4分)。免疫组化染色范围的评估方法如下：0～25%(1分)，26%～50%(2分)，51%～75%(3分)，76%～100%(4分)。将染色强度和染色范围的得分相乘得到的分数作为该张病理切片的免疫组化染色得分。关于染色结果的判定，在结果中会有详尽说明。

1.4 随访

术后采用电话或门诊进行随访，随访开始时间为手术开始时间，随访结束时间为术后死亡时间或随访截止时间，即2019年2月1日，随访期限为8年，共计45例死亡。总生存时间(Overall survival，OS)定义为手术开始至首次发现全因死亡或末次随访时间。无进展生存时间(Progression free survival time，PFS)定义为手术开始至首次发现复发或转移时间或末次随访时间。

1.5 统计学处理

采用SPSS 21.0软件进行数据分析，计数资料以频数(百分率)表示，癌组织与癌旁组织间SALL4高表达率的比较使用配对卡方检验，SALL4表达水平与临床特征间的关系采用卡方检验或者连续性校正卡方检验分析。绘制ROC曲线确定SALL4表达预测总生存结局的最佳诊断分界点。通过Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Log-rank检验比较组间生存曲线差异，OS及PFS影响因素分析采用Cox比例风险模型，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SALL4在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达情况

SALL4蛋白在食管鳞癌组织中存在过表达的情况(图1A)，其在癌旁组织中表达较低(图1B)。ROC曲线分析显示，SALL4表达预测总生存结局的最佳临床分界点为5(AUC=0.807，P<0.001)(图2)。选取SALL4表达分数5(>5被认定为高表达，≤5被认定为低表达)作为唯一的表达诊断分界点。SALL4在食管鳞癌组织和癌旁组织中的高表达率分别为57.78%和5.56%，差异具有统计学意义(χ2=56.714，P<0.001)(表1)。

表1 SALL4在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达情况[n(%)]

图1 SALL4在食管鳞癌组织及癌旁组织中的IHC染色(100×)

图2 全体患者的SALL4表达分界点评分ROC曲线分析

2.2 SALL4表达与食管鳞癌病人临床特征的关系

SALL4高表达组主要集中在分化较差的食管鳞癌患者中(71.43%vs.49.09%，P=0.036)，进一步的统计分析发现，SALL4的高表达与食管鳞癌的AJCC分期状况(P=0.015)、吸烟(P=0.002)及术中肿瘤部位(P=0.038)有关。SALL4高表达与性别、年龄、家族史、饮酒史、心脑血管疾病、糖尿病无关(P>0.05)(表2)。

表2 SALL4表达状态与患者临床特征间的关系[n(%)]

2.3 SALL4表达与食管鳞癌患者预后的关系

SALL4高表达组的食管鳞癌患者PFS较差(χ2= 5.874，P=0.015)(图3)，SALL4高表达组的食管鳞癌患者OS较差(χ2= 14.369，P< 0.001)(图4)。

图3 SALL4表达与食管鳞癌患者PFS的Kaplan-Meier曲线

图4 SALL4表达与食管鳞癌患者OS的Kaplan-Meier曲线

2.4 食管鳞癌患者预后影响因素分析

单因素Cox回归分析结果显示，在全体食管鳞癌病人中，SALL4(P=0.019)、吸烟(P<0.001)、G分级(P<0.001)以及AJCC分期(P<0.001)可能为PFS的影响因素(表3)。同时，SALL4(P<0.001)、吸烟(P<0.001)、饮酒(P=0.023)、术中肿瘤部位(P=0.015)、G分级(P<0.001)以及AJCC分期(P<0.001)可能为OS的影响因素(表3)。

表3 全体入组患者的单因素Cox回归分析

将包括SALL4在内的全部临床变量汇总，进行多因素Cox回归分析。结果显示，G分期(P=0.022)为PFS的独立影响因素。SALL4(P=0.048)、AJCC分期(P=0.014)、饮酒(P=0.005)、G分期(P=0.014)为OS的独立影响因素(表4)。

表4 全体入组患者的多因素Cox回归分析

3 讨论

Spalt(sal)基因组负责编码高度保守的锌指蛋白家族，存在多种物种中，如果蝇、蠕虫以及脊椎动物等。Spalt(sal)基因在人类中存在四个旁源基因，即SALL1、SALL2、SALL3和SALL4。SALL4是SALL基因家族的一员，为锌指转录因子，在某些肿瘤中被发现具有促进肿瘤形成的作用，并且可以判定预后。有研究证实，SALL4与正常造血功能关系密切，SALL4信号传导异常与白血病的发生息息相关，在粒细胞性白血病中，SALL4呈现过表达，并且非常可能经由Wnt/β-catenin信号传导路径来引发白血病。此外，SALL4与Bmi-1之间密切联动，对胚胎干细胞和正常干细胞的自我更新能力和多向分化潜能进行调控。在转移性的生殖细胞肿瘤中，SALL4可以认定为一个兼具特异性和敏感性的生物靶标，特别是在转移性的卵巢内胚层窦瘤的筛查中。在胃癌中，SALL4通过调控干细胞活性和细胞上皮间质转化促进肿瘤发生，并且可以被认定为一个具有诊断和治疗意义的靶点[11]。在肝癌中，同样检测到了SALL4的过表达现象[12]，并且被判定为一个治疗性靶点[7]。在小儿的肝母细胞瘤亚型中，EpCAM阳性干细胞样肝癌中，源自卵黄囊肿瘤的SALL4不同表达的肝细胞亚型中以及侵袭性肝癌中均得到了验证[7，12-15]。

在食管癌中，对50例食管鳞癌患者肿瘤组织采用相对实时荧光定量PCR技术分析发现，SALL4在食管鳞癌中存在过表达的情况，且与食管鳞癌的侵袭转移有显著相关性，只是该项研究并未涉及到SALL4的表达情况与食管鳞癌病人的生存期之间的关联[16]。在另一项食管癌组织芯片(Tissue microarray，TMA)的分析中，在腺癌中SALL4的表达和总生存率之间没有明显的相关性，由于检测的食管腺癌组织只有57例，尚不能因此妄下定论，需要后续研究加以验证。在食管鳞状细胞癌中，SALL4的表达与较差的总生存率密切相关[17]。但是，鉴于该项研究所检测的食管鳞癌组织只有55例，而且并未进行其他相关临床病理因素的综合分析，尚需进行更加完善的大样本的研究对SALL4与食管鳞癌临床病理特征及预后之间的关系加以阐述，这也正是本研究的初衷。

本研究增加了样本量，检测了90例食管鳞癌组织及癌旁组织中SALL4的表达状况。与先前的研究结果相类似，SALL4的表达水平与肿瘤的分化情况密切关联，在分化较差的食管鳞癌组织中SALL4的表达水平偏高。此外，在生存期方面，SALL4低表达组的食管鳞癌患者PFS和OS都要明显优于高表达组，SALL4被认定为一个具有判定预后价值的独立的生物标志物，这表明对于SALL4表达状态的检测可以被认定为一个新的有效的方法，可以筛选出那些极具高复发和进展风险的食管鳞癌患者。本研究的结果证实，SALL4表达水平的升高或许可以定义出一个食管鳞癌的亚型，其恶性程度较高且预后较差。由于本研究并没有纳入其他的食管癌组织类型，例如食管腺癌等，更大型的有关SALL4与食管癌的临床病理特性的研究仍需开展。

SALL4掌控细胞存亡主要通过调控一系列基因来实现的，这些基因通常都存在一些于凋亡前和抗凋亡的信号通路之中。在食管鳞癌细胞中，SALL4的过表达可能起到了维持肿瘤细胞生存的重要作用，通过抑制凋亡前基因通路中的基因来实现的，例如抑制PTEN基因。巧合的是，食管鳞癌组织中PTEN存在表达偏低或者失表达的情况[18]。基于本研究结果，我们假设，在食管鳞癌细胞中SALL4的过表达有可能会抑制PTEN，导致PTEN表达降低。SALL4可能通过与PTEN的紧密联系进而在PI3K/AKT/mTOR传导路径中有所作用。有趣的是，自噬的启动过程部分是通过PI3K/AKT/mTOR传导路径来完成的。因此我们猜想，SALL4或许能够通过调节PI3K/AKT/mTOR传导路径来参与自噬的启动，当然，这些假设和猜想仍然需要更多的进一步的体内和体外的研究来证实，这也正是下一步我们的工作方向。

综上所述，SALL4是食管鳞癌的一个具有预后判定价值的、特异性的、独立的生物标志物，可以在临床实践中有效协助筛查出预后不良的食管鳞癌患者，同时，SALL4亦可作为食管鳞癌的一个治疗靶点来进行进一步的研究。本研究结果揭示了SALL4与肿瘤细胞分化、肿瘤进展之间的微妙关系，也为食管鳞癌的病理生理学研究提供了新的思路。