基于改良QuEChERS-气相色谱-串联质谱法测定禽蛋中53 种农药残留

梁秀美, 张 井, 林定鹏, 何如意, 谢拾冰,廖琳慧, 王 亮, 徐 静, 张维一*,

(1. 浙江省温州市农业科学研究院，农业农村部农产品质量安全风险评估实验站，浙江 温州 325006；2. 浙江省丽水市莲都区农业技术推广中心，浙江 丽水 323000)

中国是禽蛋生产和消费大国，禽蛋具有较高的营养价值，其质量安全直接关系到消费者的身体健康和国家经济利益[1]。但养殖场在养殖过程中，经常会使用卫生杀虫剂来维持场内环境，如使用菊酯类、有机磷类等来消灭鸡羽虱[2]等。一些不易降解的农药会经过禽类饲料等食物链的传递、富集，进入禽蛋并积累其中[3]。人们如果长期食用含有农药甚至超标的禽蛋，可引起慢性中毒；农药长期在人体内累积会产生致畸、致癌和致突变作用[4]。因此，建立禽蛋中农药多残留的快速精准检测方法，具有非常重要的现实意义。

现行农药残留检测标准大都针对植物源性食品[5-6]，禽蛋中农药残留检测标准大多集中在氟虫腈及其代谢物的农药残留[7]，诸多农药残留缺乏有效的检测标准。动物源性食品中农药残留样品前处理方法主要有固相萃取法[8]、加速溶剂萃取法[9]、凝胶渗透色谱法[10]及QuEChERS 法[11]等。与前3 种方法相比，QuEChERS 法具有操作简便、检测成本低、环境友好、检测高效等优势，而且还可准确分离出残留的农药成分[12]。因此，本研究选取QuEChERS 方法作为样品前处理方法。农药残留检测方法主要有酶联免疫吸附法[13-14]、气相色谱法[15-16]、液相色谱法[17-18]、气相色谱-质谱联用法 (GC-MS/MS)[19-20]、液相色谱-质谱联用法[21-22]等。其中GC-MS/MS 不仅适用于复杂基质混合物的定性分析，还可以利用得到的二级质谱结果进行定量，并具有较高的灵敏度。虽已有报道利用GC-MS/MS 检测禽蛋中200 余种农药残留的方法，但该方法需要大量的有机试剂，操作繁琐[23]。本研究基于本单位日常农产品例行检测中检出率较高的农药和养殖场可能使用的卫生杀虫剂，重点针对有机氯 (包括六六六、滴滴涕等)、有机磷及拟除虫菊酯类等卫生杀虫剂和农业生产中常用的农药，在QuEChERS 样品前处理方法基础上，优化提取和净化条件，建立了可同时检测禽蛋中53 种农药残留的GC-MS/ MS 分析方法，旨在为禽蛋中农药残留的快速检测提供可操作性强的实用分析技术。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及材料

Agilent 7890B/7000D 气相色谱-串联质谱仪，配有EI 离子源 (美国Agilent 公司)；艾本德5804R冷冻高速离心机 (德国EPPENDORF 公司)；KQ-500DE 数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)；OA-SYS/N-EVAP-112 氮吹仪 (美国Organomation 公司)；MS7610-33 旋涡振荡器 (美国Thermo Fisher 公司)；Milli-Q Direct 8 超纯水仪(美国Millipore 公司)；AR1502CN 电子天平 (奥豪斯仪器有限公司)。

53 种农药标准品均购自农业农村部环境保护科研监测所，质量浓度均为100 mg/L (液态标准物质)。

十八烷基硅烷 (C18，40～63 μm)、乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA，40～63 μm)、石墨化碳黑 (GCB，120～400 目)、酸性氧化铝 (7G010005)、碱性氧化铝 (AG010005) 和硅藻土 (545) (德国CNW 公司)；弗罗里硅土 (0.150～0.250 mm) (美国WZ.der.Floridin公司)；超纯硅胶 (60～200 μm) (加拿大SILICYCLE公司)；EMR 净化管 (5 982～1 010) (美国Agilent 公司)；无水硫酸镁和二氯甲烷 (分析纯，西陇化工股份有限公司)；乙腈和正己烷 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇 (分析纯，衢州巨化试剂有限公司)；丙酮 (分析纯，浙江三鹰化学试剂有限公司)；乙酸乙酯 (分析纯，上海展云化工有限公司)；乙酸乙酯和甲酸 (色谱纯，德国默克公司)；0.22 μm 滤膜、1 mL 注射器和2 mL 样品瓶 (上海安谱实验科技股份有限公司)；试验用水为Milli-Q Direct 8 超纯水仪制备的超纯水。

供试禽蛋品种包括鸡蛋、鸭蛋、鸽子蛋、鹌鹑蛋和鹅蛋共5 种，为温州市各县市区农贸市场及养殖基地抽检样品。

1.2 检测条件

色谱条件：HP-5MS 色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm，美国安捷伦科技有限公司)；载气为氦气，流速为2.25 mL/min；碰撞气为氮气，流速为1.5 mL/min；进样口温度290 ℃；传输线温度280 ℃；柱升温程序：初始温度60 ℃ 保持1 min，以40 ℃/min 升至170 ℃，再以10 ℃/min 升至310 ℃，保持3 min；进样体积1.0 μL；不分流进样，不分流时间为1 min。

质谱条件：电子轰击离子源 (EI)；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离能70 eV；质谱接口温度280 ℃；动态多反应监测模式 (dMRM)；总运行时间20.75 min。53 种农药的保留时间及质谱参数 (按出峰顺序) 见表1，典型色谱图见图1。

续表1Table 1 (Continued)

1.3 样品前处理方法

样品制备：取约1.5 kg 禽蛋，去壳后用组织匀浆机充分搅拌均匀，于 -20 ℃保存，待测。

称取2.50 g 均质样品于50 mL 离心管中，加入10.00 mL 乙酸乙酯，超声30 min；加入2.0 g无水硫酸镁，涡旋1 min 后于6 000 r/min、-4 ℃下离心5 min；取6 mL 上清液于15 mL离心管中，加入900 mg 无水硫酸镁、150 mg 弗罗里硅土和300 mg 硅藻土，涡旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下离心5 min；取4.00 mL 上清液于5 mL 试管中，40 ℃水浴下氮吹至近干，用1.00 mL 乙酸乙酯复溶，过0.22 μm 滤膜，待测。

1.4 标准溶液配制

标准品混合中间液1 (1.00 mg/L)的配制：准确移取53 种农药标准品各0.100 mL 于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度线，于4 ℃保存，备用。

标准品混合中间液2 (0.40 mg/L，以甲基毒死蜱计) 配制：按53 种农药标准品的定量限比例，分别移取一定体积的农药标准品溶液于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度线，于4 ℃保存，备用。

基质匹配混合标准溶液1 配制：临用时，用乙酸乙酯溶液溶解的样品空白基质提取液，稀释标准品混合中间液1，配制成0.10、0. 20、0.50、1、2、5、10、20 和50 μg/L 系列质量浓度的基质匹配标准混合工作溶液1，用于确定仪器的检出限和方法的定量限。

基质匹配混合标准溶液2 配制：临用时，用乙酸乙酯溶液溶解的样品空白基质提取液，稀释标准品混合中间液2，配制成1、2、5、10、20 和50 μg/L (以甲基毒死蜱计) 系列质量浓度的基质匹配标准混合工作溶液2，用于确定方法的线性范围、准确度和精密度。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 样品提取 以鸡蛋为研究对象，通过添加回收试验，考察了不同溶剂对53 种农药的提取效果。称取2.50 g 样品 (每个处理3 个平行、1 个空白)，添加250 μL 标准品混合中间液1，静置30 min后加入10.00 mL 提取溶剂，超声30 min 后加入2.0 g 无水硫酸镁，涡旋1 min 后于6 000 r/min、-4 ℃下离心5 min；取上清液，过0.22 μm 滤膜，待GC-MS/MS 检测，空白基质匹配标准溶液外标法标准曲线定量。结果显示：乙腈、乙酸乙酯的提取效果较其他溶剂更好 (表2)。庞国芳等的研究表明，在提取液中加入缓冲试剂如甲酸，对维持溶液的pH 值及降低敏感性药物的降解有很好的作用[24-26]，故本研究考察了加入体积分数1%的甲酸对提取效果的影响。结果显示，在乙腈中加入1%的甲酸对目标物的提取效果影响不明显。考虑到乙酸乙酯的价格、毒性均较乙腈低，因此选择乙酸乙酯为提取溶剂。

表2 不同提取溶剂对53 种农药提取效果的影响 (n = 3)Table 2 Extraction efficiency of different extraction solvents on 53 pesticides (n = 3)

2.1.2 样品净化

2.1.2.1 吸附情况 本研究除对QuEChERS 方法常用净化材料C18、PSA 和GCB 进行考察外，还对超纯硅胶、弗罗里硅土、硅藻土、酸性氧化铝、碱性氧化铝和EMR 等常见的固相萃取柱填料进行了研究。GCB 虽然能够强烈吸附色素类物质，但它对非极性农药也有吸附作用，会降低大部分农药的回收率[27-28]。因此，本研究考察了备选净化材料对待测目标物的吸附情况。在2.1.1 节优化的提取条件下，取6 mL 空白鸡蛋样品提取液于15 mL 离心管中，添加600 μL 的标准品混合中间液1，涡旋、混匀；加入900 mg 无水硫酸镁、150 mg 净化剂 (每个处理3 个平行、1 个空白)，涡旋30 s 后于10 000 r/min、-4 ℃下离心5 min；取上清液，过0.22 μm 滤膜，待GC-MS/MS 检测，空白基质匹配标准溶液外标法标准曲线定量。结果显示：9 种净化剂对目标物的吸附性不强，目标物的回收率均可达到要求 (表3)。

2.1.2.2 基质效应 本研究采用相对响应值法对基质效应进行评价 (基质效应 = 空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值)，当基质效应小于1 时为基质抑制效应，反之则为基质增强效应[29]。对鸡蛋进行基质效应评价的结果显示弗罗里硅土和硅藻土的净化效果优于其他7 种净化剂。为了提高净化效果，降低基质效应，本研究又考察了弗罗里硅土和硅藻土组合对目标物的吸附情况及净化效果，结果显示目标物的回收率均可达到要求 (表3)，其中净化剂150 mg 弗罗里硅土 + 300 mg 硅藻土组合，43 种农药的基质效应在0.80～1.20 之间，净化效果优于其他组合 (表4)。为提高灵敏度，本研究取4.00 mL 净化液，于40 ℃水浴氮吹至近干，用1.00 mL 乙酸乙酯复溶，过0.22 μm 滤膜，GC-MS/MS 检测，空白基质匹配标准溶液外标法定量。结果显示目标物的回收率亦均可达到要求(表3)。基于此，本研究净化方法最终选择150 mg 弗罗里硅土 + 300 mg 硅藻土，并选用空白基质匹配标准溶液外标法标准曲线定量的方式来减弱基质效应的影响。

表3 不同净化剂对53 种农药回收率的影响Table 3 Recoveries of 53 pesticides with different clean up sorbents

表4 不同净化剂对53 种农药的基质效应评价Table 4 Matrix effect of 53 pesticides with different cleanup sorbents

2.2 方法评价

2.2.1 线性范围、检出限及定量限 取基质匹配混合标准工作溶液1，在上述优化的检测条件下，经GC-MS/MS 测定后，以目标物质量浓度为横坐标 (x)，质谱定量离子的峰面积为纵坐标 (y)，绘制标准曲线。参考GB/T 33 260.2—2018 计算目标物的仪器检出限[30]。结果 (表5) 表明，仪器检出限(LOD) 在0.000 25～0.005 mg/L 之间。方法定量限(LOQ) 以最小添加浓度且可准确定量的水平予以评价，则在0.000 5～0.01 mg/kg 之间。

确定了每个待测目标物的定量限后，取基质匹配混合标准溶液2，在上述优化的检测条件下，经GC-MS/MS 测定后，计算线性范围，绘制标准曲线。结果 (表5) 表明，目标物的线性相关系数在0.996 7～1 之间，能够满足定量分析的基本要求[31]。

表5 53 种农药的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 5 Linear regression equation, r, LOD and LOQ of 53 pesticides

续表5Table 5 (Continued)

2.2.2 方法的添加回收准确度与精密度 向鸡蛋中添加适当体积的53 种标准品混合中间液2，添加水平均分别为LOQ、2 LOQ 和10 LOQ。由表6可知，53 种化合物在鸡蛋中的平均回收率在76%～104%之间，相对标准偏差 (RSD) 在0.090%～14%之间 (n= 6)，表明方法具有较好的回收率和重现性[31]。

表6 53 种农药在鸡蛋中的平均添加回收率及相对标准偏差 (n = 6)Table 6 Average recoveries and relative standard deviation of 53 pesticides in hen’s eggs (n = 6)

续表6Table 6 (Continued)

2.3 实际样品测定结果

运用本研究建立的检测方法，对温州市各县市区销售流通环节64 个点抽检的101 个禽蛋样品进行分析 (每个样品2 个重复)，每个样品抽取1.5 kg左右。结果表明：51 个鸡蛋样品累计检出11 种农药，检出率在2%～69%之间；36 个鸭蛋样品累计检出7 种农药，检出率在3%～69 之间；6 个鸽子蛋、4 个鹌鹑蛋和4 个鹅蛋样品均累计检出毒死蜱、马拉硫磷，检出率在50%～100%之间。参考《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[32]，所有检出农药均未超标。实际样品的检测结果见表7，检出参数的多反应监测图见图2。

表7 实际市场抽检样品中53 种农药残留检测结果Table 7 Detection results of 53 pesticides in market samples

本研究中，1 个鸡蛋样品检出氟虫腈的代谢物氟虫腈砜，不排除目前养殖场仍存在使用氟虫腈等杀虫效果较强、对人类危害较大农药的可能性；虽然毒死蜱、马拉硫磷的检出浓度较低，但整体检出率较高，这可能与养殖场大量、普遍使用卫生杀虫剂来维持场内环境，或取食的植物性饲料中含有这些农药残留有关[2]。因此建议加强动物源性农药代谢物的检测与研究，以便为食品安全管理作出正确的决策提供参考。

3 结论

本研究利用基质分散固相萃取法结合气相色谱-串联质谱技术，建立了禽蛋中农药残留多指标同步定性、定量检测的分析方法。本方法使用改良的QuEChERS 前处理技术，气相色谱-串联质谱测定，基质匹配外标法标准曲线定量。对测定方法进行方法学验证，结果表明，53 种农药的仪器检出限在0.000 25～0.005 mg/L 之间，方法定量限在0.000 5～0.01 mg/kg 之间，目标物的线性相关系数 (r) 在0.996 7～1 之间；在LOQ、2 LOQ 和10 LOQ 3 个添加水平下，53 种农药在鸡蛋中的平均添加回收率在76%～104% 之间，相对标准偏差在0.090%～14%之间 (n= 6)。该方法准确、快捷、灵敏，为我国禽蛋中农药残留的高通量快速检测以及食品安全提供了科学支持和技术保障，对于推进政府监管部门执法、提高检测效率、降低检测成本等均具有一定的实际意义和社会效益，可应用于禽蛋食品安全日常监测。