脂肪乳对有机磷农药中毒大鼠肝损伤的保护作用研究

胡小东，周 春 ,康向飞，李文峰

有机磷中毒是全球最重要的急性中毒公共卫生事件，我国也是有机磷中毒高发国家之一[1]。目前，虽然相关解毒剂和血液灌流等治疗措施应用可以有效挽救患者生命，但是严重有机磷中毒患者死亡率依然很高[2]。在严重有机磷中毒中肝脏是主要损伤器官之一，也是导致死亡的主要原因，因此探索肝保护解毒药物能够为治疗有机磷中毒提供有效手段[3]。脂肪乳作为一种静脉注射制剂已经成为预防、治疗局麻药中毒的首选用药[4]。有研究发现脂肪乳剂对有机磷中毒肝损伤具有一定的保护作用，但是其具体作用机制还不明确，因此，本研究拟评价20%脂肪乳剂对有机磷中毒肝损伤的治疗作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料：2019年3月-2020年5月选择由宁夏医科大学动物实验中心人工培育的供实验用Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重为200～240 g。实验前大鼠在动物室内自由饮食饮水，光照12 h，明暗交替，保持室温22～26 ℃，湿度50%～60%，适应性喂养1周，实验前隔夜禁食。

1.2 模型制备:将大鼠按随机数字表法分为对照组(玉米油+0.9%生理盐水)、模型组(马拉硫磷+0.9%生理盐水)和治疗组(马拉硫磷+20%脂肪乳)，每组20只大鼠。模型组和治疗组通过灌胃途径给予100 mg/kg马拉硫磷(基于LD50和体重计算马拉硫磷的剂量，雄性Wistar大鼠的LD50为1 768～1 857 mg/kg)。同时对照组通过灌胃途径给予同体积的玉米油。

1.3 药物治疗:马拉硫磷灌胃10 min后，治疗组通过尾静脉给予3 mL/kg的20%脂肪乳；同时对照组和模型组通过尾静脉给予3 mL/kg的生理盐水。实验执行期间所有实验动物均正常饮水饮食。

1.4 组织取材:给药后12 h进行组织取材。腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉动物，迅速经腹主动脉采血，所有血液均置于肝素抗凝采血管中，血样经3 500 r/min离心5 min，收集上清血浆按整体积分装于冻存管中，血浆样本经液氮迅速冷冻后储存于-80 ℃冰箱中待检。之后动物在麻醉下死于失血，取出肝脏，冷却的生理盐水洗涤，在滤纸上吸干多余水分和血液，称取整体肝脏并将其立即切成两半，一半固定在4%多聚甲醛中，另一半经液氮迅速冷冻后储存于-80 ℃冰箱中待检。

1.5 检测指标:采用迈瑞全自动化学发光测定仪CL-900i全自动免疫分析仪及其配套试剂盒检测血清样本ALT和AST表达水平，将-80 ℃冰箱保存的肝组织研磨、裂解、离心后提取上清液进行肝组织MDA、SOD和GSH表达水平检测(采用酶联免疫吸附法进行检测，试剂盒购于上海康朗生物科技有限公司)，所有检测严格按照相关试剂盒操作指南进行。取肝脏左叶组织，按照HE染色操作步骤进行组织处理后，光镜下观察肝脏病理改变。采用Western blot方法观察肝脏组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。将-80℃冰箱保存肝组织经研磨、裂解、离心后提取总蛋白，12 000 r离心20 min，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。按5份样品体积与1份loading buffer混匀，100 ℃ 孵育3 min，上样体积为10～20 μl，经5%～12%SDS-PAGE分离样品后将蛋白转至硝酸纤维素膜上，以5%脱脂奶粉封闭2 h，按操作加入相应的一抗(GAPDH抗体1∶800、Bcl-2抗体1∶1 000、Bax抗体1∶1 000、Caspase-3抗体1∶1 000)及适当稀释倍数的二抗。凝胶成像系统摄相分析。以GAPDH作为内参，用靶蛋白积分吸光度(IA)值/GAPDH(IA)值显示靶蛋白相对水平。所有抗体均购自Cell Signaling Technology公司。

2 结果

2.1 各组大鼠生化指标比较:大鼠肝组织中GSH、CAT和SOD表达水平治疗组与模型组相比明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗组MDA水平与模型组相比显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05);治疗组大鼠血清ALT和AST表达水平与模型组相比也明显降低，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠生化指标比较

2.2 各组大鼠肝组织病理学改变情况:模型组大鼠肝细胞排列紊乱，出现窦状扩张，并发生球囊变性。实质内也有局灶性单核细胞聚集。治疗组大鼠肝细胞损伤减少，肝细胞有规律地排列在血窦旁，见图1-图3(封二)。

2.3 各组大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达与GAPDH比值情况:治疗组大鼠肝组织中Bax和Caspase-3蛋白表达与模型组相比明显减少，而Bcl-2蛋白表达明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2和图4(封二)。

表2 各组大鼠Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达与GAPDH比值情况

3 讨论

脂肪乳对有机磷农药肝损伤保护作用。有机磷农药主要在肝内转化代谢，当超过肝的解毒能力范围时，就会对肝脏线粒体和内质网等重要细胞器造成影响，从而导致细胞功能紊乱和死亡[5]。有研究表明，有机磷化合物可诱导肝细胞线粒体发生氧化应激，导致线粒体功能衰竭，进一步诱发细胞凋亡，加重了肝损伤[6]。同时有机磷农药增加了肝细胞中Caspase-1、Caspase-3和p53基因的表达水平，并在门静脉区域观察到组织病理学上淤血和坏死的改变[7]。在对有机磷农药暴露者的研究发现，有机磷农药中毒者的胆碱酯酶和抗氧化剂(GSH)水平降低，而MDA和Caspase-3活性增加[8]。

我们的研究中发现马拉硫磷可以使大鼠肝组织中GSH和SOD酶活性降低，而MDA酶活性升高。同时凋亡蛋白Bax和Caspase-3蛋白表达明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显减少。这进一步表明有机磷农药中毒肝损伤可能与氧化应激诱导细胞凋亡有关。我们给予脂肪乳剂治疗后可以使GSH和SOD酶活性表达明显升高，同时降低MDA酶活性(P<0.05)。脂肪乳剂治疗后降低了大鼠肝组织中凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达，升高了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达 (P<0.05)。有机磷农药增加肝脏组织的氧化应激，通过激活细胞凋亡的内在途径，极有可能导致Bax和Caspase3免疫反应活性的增加。除氧化损伤外，通过抑制线粒体呼吸复合物，有机磷农药也可能是触发细胞凋亡的一个额外的内在因素[9]。对有机磷农药中毒大鼠来说，脂肪乳剂除作为一种能量来源外，还可以通过进一步抗氧化和抗凋亡作用提供一种新的保护机制，组织病理学改变也表明脂肪乳剂能改善有机磷农药对肝组织的损伤程度。

在脂肪乳剂关于局麻药物解毒的研究中，其主要作用机制被认为是通过脂肪吸附效应，将有毒物质从机体中分离，从而降低毒性损伤发挥作用[10]。同时也有学说认为脂肪乳剂改善线粒体代谢，增加线粒体内脂肪酸的浓度，恢复细胞的能量供应，增加ATP合成也可能是脂肪乳剂解毒的作用机制[11]。关于脂肪乳剂治疗有机磷中毒的临床研究表明，脂肪乳剂对有机磷中毒患者的治疗是安全的，无血流动力学参数变化及不良反应发生[12]。一项脂肪乳剂对有机磷中毒患者的疗效及预后荟萃分析也表明，脂肪乳剂有助于改善有机磷中毒患者的预后和肝功能[13]。急性有机磷中毒救治的专家共识虽然没有明确推荐脂肪乳剂用于有机磷农药中毒治疗[1]，但是目前普遍认为其可能是一种有效的治疗手段，只是缺乏足够的临床证据支撑。在我们的研究中，通过马拉硫磷制备有机磷中毒大鼠模型，给予脂肪乳剂后可以显著逆转肝脏组织的组织学损伤。此外，我们发现脂肪乳剂治疗后细胞凋亡减少，这可能是脂肪乳剂与马拉硫磷结合降低了循环中马拉硫磷的游离水平，同时改善了肝脏线粒体代谢，减少了氧化应激和炎症损伤。

综上所述，脂肪乳剂对有机磷农药中毒肝损伤具有治疗作用,其作用机制可能与脂肪乳剂与马拉硫磷结合后阻止其进入肝脏实质中，从而抑制了细胞凋亡活动，减少了马拉硫磷的代谢量有关。除脂肪吸附理论外，脂肪乳剂还可能通过减少氧化应激和炎症反应刺激保护线粒体等重要细胞器，为细胞产生大量能量。为了进一步探讨脂肪乳剂在机体内与有机磷农药结合的多少，还需要进一步进行研究。