益肾疏肝方对去卵巢惊恐大鼠海马Glu/GABA阳性神经元表达的影响*

刘鹤玢，宋玉娟，张鹏飞，李雅婧，韩延华

1 广东省深圳市龙华区中心医院 广东深圳 518000

2 黑龙江中医药大学附属第一医院 黑龙江哈尔滨 151000

围绝经期是女性特殊生理阶段，会出现一系列与绝经相关的症状、体征及情绪心理变化，其中以情绪障碍为最不适之症。惊恐障碍（Panic Disorder，PD）是一种典型的心身疾病，主要特征为惊恐、呼吸急促、头晕心悸、震颤汗出等症状反复发作，常伴濒死感、失控感，具有预期焦虑和回避行为[1]。围绝经期女性因特殊的生理心理特点成为本病高发人群，严重影响其身心健康和生活质量[2]。现代医学认为，神经系统中的谷氨酸（Glutamic acid，Glu）和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric，GABA）是维持大脑兴奋/抑制最重要的神经递质，二者参与介导大脑中90%以上的神经传导。研究发现，GABA含量减少导致Glu/GABA平衡失调可能是情志障碍发生的病理生理基础[3]。神经解剖学研究发现，杏仁核、下丘脑、海马等脑组织共同组成“恐惧环路”，该系统异常可能与惊恐障碍发生发展密切相关[4]。现代医学治疗本病具有诸多缺陷，如不良反应多、复发率高、易药物依赖等[5-6]。因此，找寻围绝经期PD有效的中医药防治方法具有重意义。益肾疏肝方是韩延华教授治疗本病的经验方，前期临床研究证实其具有良好疗效。本研究旨在以Glu/GABA平衡失调机制入手，以Wistar雌性大鼠作为研究对象，通过建立惊恐情绪影响下去卵巢大鼠模型，观察大鼠行为学水平、血清E2水平及脑海马区Glu/GABA阳性神经元表达水平，探究益肾疏肝方在调节实验大鼠行为学、雌激素及神经递质方面所发挥的作用。

材料与方法

1 动物与环境

健康育龄未孕雌性Wistar大鼠[7]60只（SPF级），体重180～220g，鼠龄6～8周，购于北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2016-0006）。实验饲料来源于广东省医学实验动物中心，为SPF级普通饲料。大鼠自由摄食摄水，室温22～26℃，相对湿度50%～60%。

2 材料与仪器

无菌手术刀片、止血钳、剪刀 、镊子（上海医疗器械有限公司）；非可吸收外科缝合线4-0（杭州华威医疗有限公司）；显微镜（Mshot M152，广州明美科技有限公司）；显微摄影系统（Canon EOS600D）；电子天平（赛多利斯科学仪器公司）；精密鼓风干燥箱（BPG-9140A，上海一恒科学仪器公司）；医用冷藏冷冻箱（YCD-EL259A，中科美菱低温科技公司）；离心机（KUBOTA2420）；振荡混匀器（Vortex Mixer）；酶标分析仪（RT-6500，深圳雷杜生命科学公司）；旷场实验敞箱参照文献自制[8]；自动组织脱水机（LEICA ASP200S）；包埋机冷热台（Histo Core Arcadia C）；生物组织摊烤片机（孝感亚光医用技术公司）；半自动石蜡切片机（莱卡MR2245）

3 药物与试剂

伊红染液、苏木素染液（珠海贝索生物技术公司）；无水乙醇（广东光华科技股份有限公司）；标准级显微镜载玻片（江苏世泰实验器材公司）；中性树胶（上海懿洋仪器公司）；PBS solution（B548117-0500，生工生物工程公司）；水合氯醛溶液（H07022737，南方医科大学南方医院）；阿普唑仑（H32020215，江苏恩华药业）；戊酸雌二醇片（H20160679，拜尔医药保健广州分公司）；雌二醇定量分析酶联免疫检测试剂盒（201810，安徽巧伊生物科技公司）；中药颗粒：广东一方制药。4%多聚甲醛（大连美仑生物技术公司）；抗体稀释液（ABD-0030，福州迈新生物技术开发公司）；免疫组化抗原修复液（基因科技上海有限公司）；一抗：Anti-L-Glutamate antibody（ab9440）（批号：GR3221963-1，美 国 abcam 公 司）；一 抗：Anti-GABA antibody（ab171413）（批 号：GR19646-48，美国abcam公司）；二抗：NovoLink聚合物检测系统（RE7280-K，德国Leica公司）。

4 动物分组

Wistar雌性大鼠60只适应性喂养1周后，随机选取10只行假手术（A组），其余50只去卵巢大鼠随机分为5组：去卵巢组（B组）、模型组（C组）、戊酸雌二醇组（D组）、阿普唑仑组（E组）、中药组（F组），每组10只。

5 模型制备

5.1 去卵巢模型制备 参考文献制备[9]，所有大鼠禁食水12h后予10%水合氯醛（0.4mL/100g）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，于大鼠下腹部正中、耻骨联合上方1cm处行一长约2～3cm纵形切口。进入腹腔后于双侧肾脏外下方可见乳白色脂肪组织，轻提即见双侧子宫角，沿其末端摘除被脂肪组织覆盖的卵巢组织（约绿豆大小、紫红色、呈桑葚样）。假手术组大鼠在打开腹腔后仅暴露双侧卵巢。术后第5天起，逐只对每组大鼠行阴道涂片，1次/d，连续5d。根据阴道脱落细胞涂片中角化细胞所占百分率，计算角化指数。角化指数＜50%提示大鼠动情周期发生改变，符合围绝经期特点，即去势彻底。

5.2 惊恐模型制备 根据中医学“恐伤肾”理论，予“猫吓鼠”制备惊恐模型[10]。术后第10天开始，C、D、E、F四组大鼠每日接受“猫吓鼠”1h：将鼠笼放于猫笼附近，该猫凶狠善捕鼠，大鼠通过视觉（笼中大鼠可以看到猫）、听觉（听到猫的叫声及抓挠声）、嗅觉（嗅到猫的排泄物气味）等多种感官刺激体验到天敌的存在。鼠笼铁丝网可有效阻挡猫的攻击以保证大鼠安全。共连续惊吓28天。

6 实验给药

术后第10天起，逐只对每组大鼠经口灌胃，连续28天。A、B、C三组予生理盐水3mL/d；D组予戊酸雌二醇溶液3mL/d；E组予阿普唑仑溶液3mL/d；F组予益肾疏肝方混悬溶液3mL/d。给药期间，每周称重1次，根据体重变化及时调整剂量。

治疗剂量按照人和动物体表面积折算等效剂量比值表换算：大鼠剂量（g/kg）＝成人剂量（g）×0.018/0.2kg。阿普唑仑日成人剂量0.8mg，折算大鼠等效剂量0.072mg/kg。戊酸雌二醇日成人剂量1mg，折算大鼠等效剂量0.09mg/kg。中药成人日1剂口服（具体药物组成：五味子、石菖蒲、枳实各12g，山药、远志、合欢皮、益智仁各15g，龙齿、珍珠母、茯神、枸杞子、白芍各20g，郁金10g，炙甘草6g），折算大鼠等效剂量2.052g/kg。

7 观察指标

末次给药后2h行旷场实验，以此作为大鼠行为学评定指标。观察3分钟内大鼠自主运动情况。分别记录水平运动得分（水平穿越方格总和，以大鼠所有爪子均进入同一格记1分）、垂直活动得分（两只前爪离开底面，腾空或攀附四壁，每次记1分）。末次给药后24h，各组大鼠取静脉血3mL，室温静置2h，离心（2000r/min，10min）分离血清 1mL，装置于 1.5mL塑料离心管中，放置于-20℃冰箱保存待行血清E2测定。每组随机选取5只大鼠行心脏灌注，开颅取脑海马组织，在4%多聚甲醛中固定12h，放置于4℃冰箱保存待行。

8 统计方法

所有数据均采用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，P＜0.05认为有统计学差异，P＜0.01认为有显著统计学差异。

结 果

1 各组大鼠旷场实验得分比较

与A组比较，其余5组大鼠水平、垂直活动得分均明显低下，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。与C组比较，D组、E组、F组大鼠水平、垂直活动得分均显著升高，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。F组大鼠水平、垂直活动得分均明显高于去C组、D组及E组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠旷场实验得分比较（）

表1 各组大鼠旷场实验得分比较（）

与 A 组 比 较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与 B 组 比 较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 C 组比较，□P＜0.05，□□P＜0.01；与 E 组比较，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；与 D 组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01

组别 例数 水平活动得分 垂直活动得分A假手术组 10 30.10±1.58 16.60±0.92 B去卵巢组 10 16.40±1.56△△ 8.30±0.90△△□□C模型组 10 12.90±1.14△△ 4.80±0.75△△D戊酸雌二醇组 10 18.10±1.04△△□□ 7.90±0.83△△□□E阿普唑仑组 10 17.70±0.78△△□□ 7.70±1.10△△□□F 中药组 10 22.20±1.60△△**□□◆◆○○13.40±1.28△△**□□◆◆○○

2 各组大鼠血清E2水平比较

与A组比较，E组E2水平降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；B组、C组E2水平明显低下，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。F组E2水平明显高于B组、C组和E组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），与 D 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清E2水平比较（）

表2 各组大鼠血清E2水平比较（）

与 A 组 比 较，△P＜0.05，△△P＜0.01；*与 B 组 比 较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 C 组比较，□P＜0.05，□□P＜0.01；与 E 组比较，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；与 D 组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01

组别 例数 E2/pmol·L-1 A假手术组 10 373.73±47.49 B 去卵巢组 10 283.12±38.33△△C 模型组 10 256.92±44.65△△D戊酸雌二醇组 10 350.27±22.21**□□E 阿普唑仑组 10 330.08±30.57△*□□F 中药组 10 362.19±12.35**□□◆◆

3 各组大鼠海马Glu、GABA阳性神经元表达

海马CA1区Glu阳性神经元表达：与A组比较，其余5组大鼠显著增加，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。与B组比较，C组大鼠明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；E组、F组显著降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。F组显著低于C组、D组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），低于E组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

海马CA1区GABA阳性神经元表达：与A组比较，其余5组显著降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。与B组比较，C组大鼠明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；E组、F组显著增加，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。F组显著高于C组、D组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），稍高于E组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

海马CA3区Glu阳性神经元表达：与A组比较，其余5组显著增加，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。与B组比较，C组明显增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）；D组、E组、F组显著降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。F组显著低于C组、D组，差异具有显著统计学意义（P＜0.01），稍低于E组，差异无统计学意义（P＞0.05）。

海马CA3区GABA阳性神经元表达：与A组比较，其余5组显著降低，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。与B组比较，C组显著降低，F组、E组显著增加，差异具有显著统计学意义（P＜0.01）。F组显著高于C组、D组，差异具有显著统计学差异（P＜0.01），高于 E 组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表 3、表 4。

表3 海马CA1区Glu、GABA阳性神经元表达比较（）

表3 海马CA1区Glu、GABA阳性神经元表达比较（）

与 A 组 比 较，△P＜0.05，△△P＜0.01；*与 B 组 比 较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 C 组比较，□P＜0.05，□□P＜0.01；与 E 组比较，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；与 D 组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01

组别 例数 Glu GABA A假手术组 5 30.20±2.14 29.40±2.06 B去卵巢组 5 51.80±3.19△△ 18.20±2.48△△C 模型组 5 60.40±4.41△△* 14.60±2.21△△*D戊酸雌二醇组 5 49.60±2.06△△□□ 20.40±1.97△△□□E 阿普唑仑组 5 42.60±1.36△△**□□○○ 22.60±1.88△△**□□F 中药组 5 38.80±2.32△△**□□○○◆ 24.80±1.95△△**□□○○

表4 海马CA3区Glu、GABA阳性神经元表达比较（）

表4 海马CA3区Glu、GABA阳性神经元表达比较（）

与 A 组 比 较，△P＜0.05，△△P＜0.01；*与 B 组 比 较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 C 组比较，□P＜0.05，□□P＜0.01；与 E 组比较，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01；与 D 组比较，○P＜0.05，○○P＜0.01

组别 例数 Glu GABA A假手术组 5 26.20±2.14 25.80±1.94 B去卵巢组 5 48.20±2.79△△ 15.60±1.50△△C 模型组 5 54.60±3.26△△* 12.20±1.06△△**D戊酸雌二醇组 5 44.60±1.85△△**□□ 15.40±1.88△△□□E阿普唑仑组 5 38.60±2.33△△**□□ 18.20±1.86△△*□□○F 中药组 5 34.80±2.40△△**□□○○ 20.80±1.06△△**□□○○◆

讨 论

本研究通过“猫吓鼠”制备大鼠恐惧情绪，将猫作为应激源进行刺激，随着应激次数增多，大鼠活动性、兴奋程度、适应能力受抑制状态越来越明显，焦虑、惊恐程度显著加剧。旷场实验是用于评估、探究实验动物行为、情绪状态的经典方法，在实验研究中经常被使用[5]。水平活动反映大鼠活动与兴奋性，垂直活动反映对陌生环境的适应性。将两个维度之和作为旷场实验总分，即从总体上反应大鼠行为学水平。通过对大鼠的旷场实验行为学评定，也完成了对惊恐造模成功的明确指认和验证。研究结果表明，在3个治疗组中，中药组效果最好。益肾疏肝方功效补肾疏肝、宁心安神，既可调节去卵巢所致肾虚，纠正“猫吓鼠”所致“恐伤肾”，又能纠正“肾脑失济”状态。

雌激素具有调节女性生殖内分泌、调控情绪认知、调节大脑神经传导、影响神经递质功能，通过一系列复杂的生理学、心理学机制，影响中枢神经系统，雌激素受体基因转录也有助于调节情绪行为变化[11]。雌激素缺乏与脑功能之间的关系已受到普遍关注[12]。雌激素水平减少，会直接破坏神经元生长，神经递质活性下降，大脑功能衰退，产生负性情绪[13-14]。与同期健康者比较，情志障碍者雌激素水平降低更为显著[15]。围绝经期PD发生与卵巢功能衰退、雌激素水平低下导致大脑功能退化密切相关。本研究结果发现，中药益肾疏肝方能够参与调节性激素合成与转化，提高去卵巢惊恐大鼠内源性雌激素水平，改善恐惧情绪。

Glu/GABA分别为中枢神经系统中最重要的兴奋/抑制氨基酸类神经递质。二者平衡对于稳定中枢神经系统神经元结构、维持大脑神经细胞兴奋/抑制平衡状态发挥重要作用[16]。GABA通过GABA能通路包括GABA受体、GABA的合成代谢或Glu/GABA稳定发挥中枢兴奋性神经元抑制作用产生镇静作用[17]。当平衡状态被破坏时会出现焦虑、抑郁、恐惧等情绪障碍等精神类疾病的发生[18]。本研究是以Glu/GABA作为切入点探究益肾疏肝法调节脑功能的作用机制。神经解剖学研究证实，“恐惧环路”结构主要包括杏仁核、下丘脑、海马等。海马作为大脑额叶边缘皮质的特殊区域，既是应激损伤敏感区，也是HPA轴的高位调节中枢，是大脑边缘系统的重要组成部分，参与学习、记忆，与情绪、行为活动密切相关[19]。海马组织内传入神经元和传出神经元均属于Glu能神经元，中间神经元均为GABA能神经元。应激损伤发生时，HPA轴被过度激活，糖皮质激素水平显著升高，Glu释放含量增加，GABA水平明显下降[20]。海马区内Glu长时间高水平状态会损伤海马神经元的兴奋性。细胞外过量Glu又使HPA轴功能亢进，再度释放糖皮质激素，进一步削弱海马对HPA轴负反馈调节作用，而GABA与GABAA受体结合后，HPA轴也会受到明显抑制。PD患者发病时，GABA和Glu能系统激活HPA轴。海马中Glu和GABA水平变化是情绪障碍发生、情绪行为异常的重要因素。因此，本实验通过建立惊恐情绪影响下去卵巢大鼠模型，将“恐惧环路”结构中的重要一环、与情绪行为活动密切相关的海马作为脑组织的重点区域进行研究，运用免疫组织化学法，检测各组大鼠海马GABA及Glu能阳性神经元表达的变化，从Glu/GABA角度探究益肾疏肝法调节脑功能的作用机制。本研究发现，惊恐情绪影响下去卵巢大鼠海马CA1、CA3区域Glu阳性神经元表达明显增加，GABA阳性神经元表达明显减少，致Glu/GABA失衡。益肾疏肝方能够显著降低Glu阳性神经元表达，提高GABA阳性神经元表达，有助于改善惊恐情绪影响下去势大鼠海马CA1、CA3区域Glu/GABA失衡状态。

本病属中医学“五志”中“恐”的范畴。肾藏精，精生髓，髓上奉于脑。“脑为髓之海”，大脑为精髓、神明汇聚之处，是精神、意识、思维活动之纽带。女子年值“七七”，肾气虚，精血衰，天癸竭，脑窍失养，肝失疏泄，心神失养，神明则乱。“恐伤肾”，恐惧作为一种不良情绪刺激，损伤肾气，致肾气肾精不足。因此，肾气渐衰，肾精亏虚，机体功能失调是本病发生的根本原因。益肾疏肝方由五味子、枸杞子、山药、益智仁、龙齿、远志、珍珠母、石菖蒲、合欢皮、茯神、郁金、白芍、枳实、炙甘草组成。全方以“固肾”为核心，调补肾之阴阳，促其恢复平衡，益肾疏肝并重，予重镇安神、养心安神、清心除烦，使心肾交通，心神安宁。配伍入胆经药物使胆司其职。同时顾护脾胃。全方既强调重点，又各脏腑兼顾，所用药物平和，体现了中医学辨证施治之特点。

基于前期研究结果，结合本研究领域最新研究动态，课题组提出下一步研究方向：即从Glu/GABA平衡失调机制入手，以NMDAR1、GABAA受体β2亚基作为研究对象，测定大鼠海马NMDAR1、GABAAβ2蛋白表达，深入探讨益肾疏肝方调节大鼠海马Glu/GABA系统的作用机制，对于找寻本病发病规律，完善防治方法具有重要意义。