中药材卷柏的分子鉴定及其总酚酸的含量测定*

席彩彩 徐云玲 戴关海 童晔玲 任泽明 陈思思 吴人照#

1 浙江省中医药研究院 浙江 杭州 310007

2 浙江大学生命科学学院 浙江 杭州 310058

中国药典2020版中规定卷柏（Selaginellae Herba）为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina（Beauv.）spring或垫状卷柏Selaginella pulvinata（Hook.et Grev.）Maxim.的干燥全草[1]，所以市场上的卷柏药材植物来源有两种。卷柏（S.tamariscina）为蕨类卷柏科（Selaginellaceae）卷柏属（Selaginella）多年生草本植物，功能主要为破血散瘀，活血止血，被广泛应用于临床实践。卷柏干旱时植株向内卷成一团，颜色枯黄，一旦遇水，便会植株伸展、返绿，因此民间常称其为“九死还魂草”[2-3]。卷柏中含有大量酚酸类化合物，有很强的抗氧化活性，卷柏复苏机理与其抗氧化活性密切相关[4-5]。卷柏总酚酸含量测定未见文献报道。本文采用DNA条形码技术鉴定卷柏药材来源，采用NaOH滴定法和福林酚比色法测定卷柏总酚酸含量，为卷柏药材来源的准确快速鉴定、酚酸类化合物的研究提供参考，为揭示卷柏复苏机理及其综合开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂：Bio-Rad C1000 PCR扩增仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统（BIO-RAD公司）；MAPADA紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；离心机TGL-16G（上海安亭科学仪器厂）；5000ml电热套、循环水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）、旋转蒸发仪、DHG-9140A电热恒温鼓风干燥箱、万分之一分析天平JA5003B。DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。对照品均购自中国食品药品检定研究院，实验所用试剂均为分析纯。

1.2 材料：本实验选用5个样品材料，材料1、2和5分别为2016年11月、5月和9月自山东收集的药材全草；材料3为2016年11月采自江苏省连云港的药材全草；材料4为2016年5月自广西收集的药材全草。

2 方法

2.1 分子鉴定：将液氮保存的样品取出，室温放置5min，按DNA提取试剂盒说明书操作提取DNA，经1.0%琼脂糖凝胶电泳后用Bio-Rad Gel Doc XR＋凝胶成像系统观察提取的DNA质量并拍照。采用PCR扩增[6]，前引物 ：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT，后 引 物 ：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT。反应体系为25μl：10×PCR缓冲液 2.5μl，MgCl2（25mmol/L）1.5μl，dNTP（25mmol/L）2μl，引物（10nmol/L）各1μl，Taq酶（5U/μl）0.2μl，DNA模板2μl，ddH2O补充至25μl。PCR扩增程序：94℃预变性 5min；94℃变性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸45s，共40个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。得到序列后提交至NCBI经由BLAST对比确定药材植物来源。

2.2 总酚酸含量测定：具体如下。

2.2.1 提取方法：取500g材料1干燥切碎，经回流提取后依次经过PET、EtOAc、n-BuOH萃取，回收溶剂得到不同极性部位。EtOAc部位加5%NaHCO3溶液，得到5%NaHCO3溶液层和油层，5%NaHCO3溶液层加入酸水（1%～3%HCl，调pH=2），析出沉淀，用EtOAc萃取，回收溶剂得到浸膏（有机酸类）；油层加1%NaOH溶液，得到1%NaOH溶液层，加入酸水（1%～3%HCl，调pH=2），析出沉淀，用EtOAc萃取得到浸膏（酚类）；n-BuOH部位处理方法同EtOAc部位，最终分别将EtOAc部位和n-BuOH部位的有机酸类、酚类合并，得到有机酸样品1.60g，酚类样品0.88g，备用。

2.2.2 有机酸含量测定：①标准NaOH滴定液的配制：精密称取NaOH粉末4.1358g于1000ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀。精密称取基准邻苯二甲酸氢钾2.0956g，加水定容，量取10ml邻苯二甲酸氢钾溶液，加0.2%酚酞指示液2滴，用新配置的NaOH溶液滴定，至溶液显粉红色。重复滴定3次，取消耗的NaOH平均值，得到配制的NaOH浓度为1.009mol/L。②莽草酸对照品溶液的制备和滴定：精密称取莽草酸对照品12mg于100ml容量瓶中，加适量无水乙醇溶解并定容即得对照品溶液。准确量取10ml对照品溶液置烧杯中，加酚酞指示液2滴，用标定的NaOH溶液滴定，重复滴定3次，记录每次消耗的NaOH溶液的体积，平均消耗NaOH溶液0.15ml。经计算得1ml NaOH溶液相当于66.67ml莽草酸溶液，即相当于0.0054g莽草酸对照品。③线性关系考察：精密移取0、5、10、15、20、25、30ml莽草酸标准溶液于锥形瓶中，用标定的NaOH溶液滴定，重复滴定3次，以NaOH溶液用量（ml）Y为纵坐标，莽草酸质量（mg）X为横坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=0.1232X+0.0025，R2=0.9991，线性良好。④供试品溶液的制备：取有机酸样品0.0309g于100ml容量瓶中，加少量无水乙醇溶解并定容，备用。⑤测定方法：精密吸取供试品溶液5ml于烧杯中，加酚酞指示液2滴，参照标准曲线制作方法测定样品中总有机酸的含量，以莽草酸计。

2.2.3 酚类化合物含量测定：①对照品溶液的制备：精确称取丁香酸对照品0.0145g于100ml容量瓶中，蒸馏水溶解并定容，得到浓度为145μg/ml的丁香酸标准品溶液，备用。②供试品溶液的制备：精密称取样品0.0934g于100ml容量瓶中，加20ml6%乙醇溶解并定容，备用。③最佳测量波长的选择：精密移取0.5ml的丁香酸标准溶液和供试品溶液，加入蒸馏水5.0ml，混匀后加入福林酚试剂1.0ml，摇匀，静置30s后加入质量分数为12%的Na2CO3溶液3.0ml用蒸馏水定容至25ml，25℃下避光反应2h后进行波长扫描，选择582nm作为最佳测量波长。④线性关系考察：分别精密移取丁香酸标准溶液0、0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.5ml于25ml容量瓶中，分别加入福林酚试剂3.0ml，摇匀，静置30s后操作参考“③最佳测量波长的选择”，以0样为空白对照，在582nm波长下测量吸光度，每个样品重复测定3次，取平均值，以标准溶液的吸光度Y为纵坐标，标准溶液的浓度（μg/ml）X为横坐标绘制标准曲线。回归方程为Y=0.0108X+0.0121，R2=0.9942，线性良好。⑤碳酸钠用量的选择：分别精密移取7份丁香酸标准溶液0.5ml于25ml的容量瓶中，福林酚比色法过程中分别加入12%Na2CO3溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，其他条件不变，每个样品重复测定3次，取平均值，绘制曲线图，分析实验结果，得出福林酚试剂与Na2CO3溶液的最佳体积比。⑥福林酚试剂用量的选择：分别精密移取6份丁香酸标准溶液0.5ml于25ml的容量瓶中，福林酚比色法过程中分别加入福林酚试剂0.25、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5ml，12%Na2CO3溶液用量与福林酚试剂相同，其他操作不变，每个样品重复测定3次，取平均值，绘制曲线图，分析实验结果，得出福林酚试剂的最佳用量。⑦显色时间的选择：精密量取6份供试品溶液1.0ml于25ml的容量瓶中，福林酚比色法过程中加入福林酚试剂2.0ml和相同体积的12%Na2CO3溶液，25℃下分别避光静置0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0h，其他操作不变，每个样品重复测定3次，取平均值，绘制曲线图，分析实验结果，得出最佳反应时间。⑧样品的测定：精密量取1.0ml供试品溶液，以优化的福林酚比色法的最佳条件处理样品，在582nm波长下测量吸光度，计算样品中总酚类化合物的含量，以丁香酸计。

3 实验结果

3.1 分子鉴定实验：提取的5个DNA样品经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后经凝胶成像系统观察拍照结果（图1）显示提取的DNA质量较好，可用于后续实验。经测序，得到的结果（图2）与BLAST序列对比表明5个样本中1、3、4、5 为 卷 柏 Selaginellatamariscina（Beauv.）spring，样本2为垫状卷柏Selaginella pulvinata（Hook.et Grev.）Maxim，因此选择样本1作为后续实验的实验材料。

图1 卷柏样品的DNA凝胶电泳图

图2 卷柏样品的ITS2序列图

3.2 有机酸含量测定实验：NaOH溶液平均消耗量为0.10ml，计算出卷柏供试品中有机酸含量为51.2%。因500g卷柏中共提取到有机酸样品1.6g，因此本次实验测得卷柏中有机酸含量为0.16%。

3.3 酚类化合物含量测定：具体如下。

3.3.1 碳酸钠用量的确定：随着12%Na2CO3溶液用量的增加，吸光度呈不断增大的趋势，当12%Na2CO3溶液的体积增加至1.0ml时，即福林酚试剂与12%Na2CO3溶液的体积比为1∶1时，吸光度达到最大，之后基本处于较为稳定的状态。因此福林酚试剂与12%Na2CO3溶液的最佳体积比为1∶1（图3-A）。

3.3.2 福林酚试剂用量的确定：当福林酚试剂的用量不断增加时，丁香酸标准液的吸光度也随之呈现上升趋势，当福林酚试剂的用量增加到1.0ml时，吸光度达到最大，随后变化趋于平缓，因此福林酚试剂的最佳用量为反应液的2倍（图3-B）。

3.3.3 显色时间的确定：在2h以内的显色是不完全的，随着时间的延长，吸光度呈现上升趋势。2h时吸光度达到最大，2h以后吸光度随着时间的延长出现下降趋势但随后又基本处于稳定状态，说明反应2h后显色完全，因此，显色完全的最佳时间为2h（图3-C）。

图3 福林酚比色法条件优化图

3.3.4 样品测定结果：样品的吸光度平均值为0.269，计算出卷柏样品中酚类含量为63.67%。因500g卷柏中共提取到酚类样品0.88g，所以本次实验测得卷柏中酚类含量为0.11%。

4 讨论

本文总结了采取分子鉴定法鉴别5个药材的植物来源，结果证明1、3、4、5均为卷柏S.tamariscina，2为垫状卷柏S.pulvinata，选择药材1作为后续含量测定的实验材料，保证了实验材料的准确性。有机酸的检测采用最传统的酸碱滴定法，选用卷柏中已经分离鉴定的莽草酸做对照品，可被大部分科研人员所接受，增加了实验结果的可靠性。所采用的优化的福林酚比色法条件试剂用量少，操作简单，适宜卷柏样品总酚类含量的测定。本次实验全部采用经典测定方法，实验结果准确可靠，为卷柏酚酸类成分的研究提供依据，也为后续揭示卷柏复苏机理及其综合开发利用奠定基础。