CB1R参与水杨酸钠诱导大鼠耳鸣研究

葛佳丽 李婷李雅兰肖倩文左健王采集乔月华*

1徐州医科大学（江苏221004）

2徐州医科大学形态学科研实验中心（江苏221004）

3江苏省人工听觉工程实验室（江苏221004）

4徐州医科大学附属医院（江苏221002）

耳鸣是指在无外界声、光刺激的情况下，患者主观所感知到的一种异常的声音症状。据不完全估计我国耳鸣患者有1.2亿，约占总人口的10%，其中进行求医治疗的仅有5%[1]。但迄今为止耳鸣具体发病机制仍然尚未明确，临床诊疗效果差，患者仍承受着耳鸣的痛苦。因此，深入研究耳鸣发病机制是解决这一世界性医学难题的唯一希望。

现有研究显示大剂量水杨酸可引起人和动物出现听力下降和耳鸣[2]，同时也是目前国内外耳鸣动物模型的构建方法，该模型具有快速、高效、方便、稳定的优势[3,4]。目前研究认为水杨酸钠破坏听觉通路中兴奋和抑制之间的平衡，改变突触可塑性，导致耳鸣的发生发展[5]。

CB1R首先在大脑中被发现且其在中枢神经系统以及外周神经系统中均存在表达[6]。CB1R通过抑制突触前终末γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸的释放以及氮氧化物的产生，具有抗兴奋毒性作用、神经保护作用[7]，或许在水杨酸钠诱导耳鸣过程中存在重要调控机制。

因此，本研究在水杨酸诱导大鼠耳鸣模型中，以听觉中枢信号传导起始部位——蜗核为重点研究对象，探索CB1R在不同时间水杨酸诱导耳鸣模型中的表达变化，对其可能机制进行深入讨论。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物的选择

本次实验使用健康、雄性清洁级SD大鼠60只，体重为250～270克，购买自徐州医科大学实验动物中心。实验期间所有大鼠均饲养于通风屏障系统内，室温为24℃～26℃，12小时光照交替，自由饮水进食，保持垫料干燥洁净。本实验所有流程符合徐州医科大学动物中心动物伦理管理条例规定。

1.1.2 试剂

实验用水杨酸钠购买于美国Sigma公司（置于4℃冰箱长期保存），BCA测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），兔多克隆抗CB1抗体（Abcam公司），鼠单克隆抗β-actin（美国Proteintech公司），CB1R引物以及内参β-actin（上海生工生物工程有限公司），羊抗兔荧光二抗（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立及分组

所有动物模型的建立均参照先前研究稳定模型[8]。本次实验随机选取雄性SD大鼠60只，按随机分组法分为NS 7天组、SS 7天组、NS 14天组、SS 14天组，每天分别给予SS组7%SS 200mg/kg，对照NS组给予相同剂量0.9%NS腹腔注射。连续给药，每日两次，给药时间分别为上午8时以及下午16时。

1.2.2 PPI检测

水杨酸钠诱导大鼠耳鸣样行为的检测均参照既往研究[9]。先随机给予大鼠10次115dB SPL的脉冲刺激，紧接着随机给予30次声刺激，包括10次115dB SPL脉冲刺激、10次没有前声的惊跳反射刺激和10次前脉冲惊跳反射刺激。惊跳刺激的时间间隔为27-32s。PPI值计算公式为（1-PPI/ASR）×100%。随后再次根据公式 PPI（%）=1-（ASRPPI）/ASR×100%，计算前脉冲抑制率。

1.2.3 ABR检测

ABR测试用Neurosoft公司听觉脑干诱发反应仪于隔音屏蔽室中进行。4%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠进入麻醉状态后，将记录电极置于外耳道口与颅正中线交叉处皮下插入颅骨与硬脑膜之间，参考电极置于两侧乳突皮下，接地电极置于尾巴根部,给声音耳机放置距左侧外耳道口0.5cm。分别给予大鼠不同频率的声信号：Click、Tone burst(6k、8k、10k、12k、16k)。从 80dB SPL开始测试，以10dB SPL逐级递减，采用“升5降10法”反复测量以确定最低听阈。

1.2.4 Q-PCR

提取蜗核部位总RNA，用所获取RNA样本反转录合成cDNA后再进行荧光定量扩增检测，以βactin作为内参基因，对比分析判断目的基因CB1R表达情况。CB1R引物上游：CCTGCTGAACTCCACCGTGAAC，下游为：CTGTGTTGTTGGCGTGCTTGTG；内参β-actin引物上游：CCCTGGCTCCTAGCACCAT，下游：TAGAGCCAATCCACACAG。均由上海生工生物工程有限公司合成。CB1R基因表达变化采用比较阈值法即计算2-△△CT[10]。

1.2.5 Western Blot

取适量组织置于蛋白酶抑制剂和裂解液中匀浆，离心后收集上清，测定蛋白浓度。电泳分离蛋白后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗选用兔多克隆抗CB1R（1:200）和鼠单克隆抗GAPDH（1:5000）孵育过夜，TBST洗涤后，荧光标记二抗(1:150)室温孵育2h，TBST再次洗涤后，应用Odyssey红外成像系统（美国Li-COR公司）扫描蛋白条带。选用GAPDH作为内参照，并用Image J软件对免疫印迹条带进行半定量分析。

1.2.6 免疫荧光染色

实验前将制备的16um冰冻切片室温下放置20-30min复温；PBS清洗后封闭（5%山羊血清与10%Triton按100：3的比例混合）；一抗为兔多克隆抗CB1R（1:200）孵育过夜，二抗为羊抗兔红色二抗（1：200）孵育1h。DAPI复染，PBS漂洗后滴加抗荧光淬灭封片胶后盖上玻片，指甲油封片，正置荧光显微镜下观察拍照，统计脑片单位面积平均荧光强度。

2 数据分析

采用SPSS16.0统计学软件对数据进行分析，两组间均数差异性比较使用独立样本t检验，多组间均数差异性比较使用单因素方差分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 水杨酸钠诱导大鼠耳鸣行为的产生

与对照NS7天组相比，SS7天组大鼠PPI2、PPI4以及PPI8均有显著增加（t=-5.325,P=0.006;t=-8.148,P=0.001;t=-3.301,P=0.03,P<0.05）；与NS14天相比，SS14天组大鼠PPI2、PPI4以及PPI8均有显著增加（t=-13.858,P=0.000;t=-4.872,P=0.008;t=-4.712,P=0.009,P<0.05）,具有统计学意义（图1）。前脉冲抑制率越大，惊跳反射被抑制的幅度越小。注射水杨酸盐后大鼠出现耳鸣样行为，耳鸣填补了背景噪声的间隔，从而减小了前抑制作用。

图1 水杨酸钠注射后对于前脉冲抑制率的影响。A、B分别为给予SS7天与SS14天后大鼠前脉冲抑制率变化；前脉冲刺激：PPI2：75dB SPL；PPI4:80dB SPL；PPI8：85dB SPL(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)（n=15）。Fig.1 Effect of sodium salicylate injection on the inhibition rate of prepulse.A and B show the changes of pre pulse inhibition rate of rats after 7 and 14 days of chronic injection of sodium salicylate;pre pulse stimulation:PPI2:75dB SPL;PPI4:80dB SPL;

PPI8:85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)(n=15).

3.2 水杨酸钠引起大鼠短暂性听力下降

应用ABR检测仪对大鼠听力阈值检测后发现（图2）：相比于对照NS7天组，SS7天组大鼠听力阈值均有上移（t=-2.0,P=0.116;t=-0.5,P=0.643;t=-1.0,P=0.374;t=-0.378,P=0.725;t=-1.0,P=0.374;t=-1.225,P=0.288,P>0.05），与NS14天组相比，SS14天组大鼠听阈均有上移（t=-1.414，P=0.23;t=-2.121,P=0.101;t=-2.121,P=0.101;t=-2.0,P=0.116;t=-0.707,P=0.519;t=-1.061,P=0.349，P>0.05），但并无统计学差异。注射水杨酸钠后，不同时间组不同频率下耳鸣大鼠均伴有轻微听力损失出现。

图2 不同时间慢性注射水杨酸钠后对于大鼠听力影响。A、B分别为给予SS慢性注射7天与14天后大鼠听力阈值变化；数值均用均数±标准差表示（n=15）。Fig.2 Effects of chronic injection of sodium salicylate at different times on hearing of rats.A and B show the change of hearing threshold of rats after 7 and 14 days of chronic injection of sodium salicylate;the values are expressed by mean±standard deviation(n=15).

3.3 CB1R在蜗核中mRNA表达

实时荧光定量PCR结果分析显示（图3）：SS注射7天后，CB1R在大鼠蜗核中的表达均有明显增加（t=2.968,P=0.0412,P<0.05），而在 SS注射 14天后，CB1R在大鼠蜗核中的表达均有明显降低，差异具有统计学意义（t=4.168,P=0.014,P<0.05）。

图3 水杨酸钠诱导耳鸣模型中CB1R在蜗核中mRNA表达变化。A：SS注射7天后耳鸣大鼠蜗核中CB1 mRNA表达增加（P=0.0412,*P<0.05）（n=5）；B：SS注射14天后耳鸣大鼠蜗核中CB1 mRNA表达减少（P=0.014,*P<0.05）（n=5）。Fig.3 Changes of CB1R mRNA expression in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A:CB1 mRNA expression increased in the cochlear nucleus of tinnitus rats after 7 days of sodium salicylate injection(P=0.0412,*P<0.05)(n=5);B:CB1 mRNA expression decreased in the cochlear nucleus of tinnitus rats after14 days of sodium salicylate injection(P=0.014,*P<0.05)(n=5).

3.4 CB1R在蜗核中蛋白表达

蛋白结果分析显示（图4）：SS注射7天后，CB1R在大鼠蜗核中的表达均有明显增加（t=2.866,P=0.0457,P<0.05），而在SS注射14天后，CB1R在大鼠蜗核中的表达均有明显降低，差异具有统计学意义（t=3.216,P=0.0324,P<0.05）。

图4 水杨酸钠诱导耳鸣模型中CB1R在蜗核中蛋白表达变化。A：SS注射7天后耳鸣大鼠蜗核中CB1R蛋白表达增加（P=0.0457,*P<0.05）（n=5）；B：SS注射14天后耳鸣大鼠蜗核中CB1R蛋白表达减少（P=0.0324,*P<0.05）（n=5）。Fig.4 Protein expression of CB1R in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A:after 7 days of sodium salicylate injection,CB1R protein expression in the cochlear nucleus of tinnitus rats increased(P=0.0457,*P<0.05)(n=5);B:after 14 days of sodium salicylate injection,CB1R protein expression in the cochlear nucleus of tinnitus rats decreased(P=0.0324,*P<0.05)(n=5).

3.5 CB1R在蜗核中荧光表达

免疫荧光结果分析显示（图5）：SS注射7天后，CB1R在大鼠蜗核中的表达均有明显增加（t=2.207,P=0.0423,P<0.05），而在SS注射14天后，CB1R在大鼠蜗核中的表达均有明显降低，差异具有统计学意义（t=8.234,P=0.0000,P<0.05）。

图5 水杨酸钠诱导耳鸣模型中CB1R在蜗核中平均荧光强度表达变化。A，C：SS注射7天后耳鸣大鼠蜗核中CB1R平均荧光强度增加（P=0.0423,*P<0.05）（n=5）；B，D：SS注射14天后耳鸣大鼠蜗核中CB1R平均荧光强度减少（P=0.0000 ,****P<0.0001）（n=5），标尺20μm。Fig.5 Changes of CB1R expression in cochlear nucleus of tinnitus model induced by sodium salicylate.A,C:after 7 days of sodium salicylate injection,the average fluorescence intensity of CB1R in the cochlear nucleus of tinnitus rats increased(P=0.0423，*P<0.05)(n=5);B,D:after 14 days of sodium salicylate injection,the average fluorescence intensity of CB1R in the cochlear nucleus of tinnitus rats decreased(P=0.0000,****P<0.0001)(n=5)，Scale bar:20μm.

4 讨论

早在1991年早期放射自显影研究中，CB1R在耳蜗核（CN）中就已被发现[11]；2007年Zheng等人第一次系统性地研究了在大鼠耳蜗核中CB1R空间分布，通过免疫组化法定位CB1R在耳蜗背侧核和腹侧核不同细胞类型中均有表达，且在水杨酸诱导耳鸣大鼠中发现腹侧蜗核中CB1R表达明显减少[12]；2016年Toal K L等人研究显示CB1R敲除小鼠对于高频8kHz～24kHz的声音辨别能力有明显缺失[13]；2016年Hwang等人研究发现在小鼠耳鸣模型中，CB1R在蜗核、脑干和下丘、海马和海马旁、颞叶以及额叶中均有表达且表达明显降低[14]。以上证据均证实CB1R不仅在听觉系统中必不可少，而且在水杨酸诱导耳鸣的过程中也发挥着重要的作用。

CB1R在突触发育以及可塑性调节中具有重要作用。研究表显示在听力开始前(P5)和听力开始时(P12)的大鼠中，CB1R调节发育中的MNTB（斜方体中核）-LSO（外侧上橄榄核）突触的强度[15]；除此之外，当GABA能神经元上CB1R敲除时，小鼠海马CAl区锥体神经元的顶树突和底树突的分枝长度及顶树突的树突棘密度均有明显减少，长时程增强（LTP）作用减弱，突触可塑性被损害；而在谷氨酸神经元上CB1R敲除后，锥体神经元顶树突的分枝长度及树突棘密度均明显增加，LTP作用因此增强[16]。王洪田等人在透射电镜观察下发现水杨酸诱导耳鸣大鼠听皮层突触形态学发生异常，突触的数量、形态、界面曲率、突触间隙、面积、活性区以及突触后致密物质厚度均有明显增加变化[17]。这些结果显示CB1R是参与中枢神经系统突触发育调节的重要受体之一，而水杨酸诱导耳鸣可能是CB1R参与调节突触重塑改变的过程。

本次实验结果分析发现，水杨酸钠连续注射7天以及14天诱导耳鸣样行为的产生。且在蜗核中CB1R在7天耳鸣模型中表达增加，14天耳鸣模型中CB1R表达降低。CB1R在14天耳鸣模型中表达降低这与Zheng等人研究结果一致，但在随后更多的研究中显示CB1R激动剂的使用并未缓解耳鸣，反而加重了大鼠耳鸣程度，不适合用于临床药物治疗[18-22]。这样结果的原因可能是相比于抑制兴奋性神经递质的释放，可能CB1R对于抑制性神经递质释放的抑制作用更强。因此本文研究认为CB1R在7天和14天耳鸣模型表达变化可能原因有两点：一点可能是由于钙离子内流、NMDAR过度兴奋继而CB1R激活，表达增加，发挥其抗兴奋毒性作用，但CB1R对GABA释放抑制作用更强，兴奋抑制平衡未能恢复，而长期过强兴奋毒性刺激导致CB1R出现负反馈调节；另一点可能是由于水杨酸诱导耳鸣产生以及维持的过程中CB1R通过介导兴奋性以及抑制性递质的释放诱导突触后LTP以及LTD产生，导致突触损害并出现重塑性变化。因此尽管既往研究显示CB1R具有抗兴奋毒性以及神经保护作用，但本次蜗核研究结果中却并未发现，CB1R在不同时间模型中变化反而显示其可能会促进耳鸣的发生发展。

总之，内源性大麻素受体在长期应用水杨酸钠从而导致耳鸣的发生发展的过程中发挥着重要的作用，但在这过程中CB1R可能调节突触重塑的机制还需要进一步实验探究。