覆盖遮荫及生产季节对蒸青绿茶滋味和香气物质的影响

方奇挺 金 晶 朱雨梦 叶俭慧 董俊杰 梁月荣

（1.浙江大学茶叶研究所，浙江 杭州 310058；2.浙江省农业技术推广中心，浙江 杭州 310000；3.浙江骆驼九宇有机食品有限公司，浙江 杭州 310000）

蒸青绿茶是采用“高温、短时”的蒸汽杀青工艺制成的绿茶，具有干茶色泽深绿、茶汤浅绿和茶底青绿的“三绿”品质特征［1－2］。玉露是日本的高级绿茶，品质优良，在采摘前经过二十天左右的遮荫处理，再经蒸汽杀青等加工工艺制作而成，具有滋味甘甜、苦涩味少，干茶色泽深绿，呈针状，具有独特的嫩香和收敛风味［3］。由于绿茶具有抗衰老、防辐射、提神醒脑、降血糖等健康功效［4］，绿茶的市场需求量一直较高。蒸青绿茶因具有优良的品质产销量增长迅速，已成为我国绿茶产品的重要品类［5］，同时蒸青绿茶亦是茶饮料的重要原料。

覆盖遮荫是生产玉露茶必要的茶园栽培管理措施，能明显改善茶叶的滋味和汤色［6］。一般采用棚架覆盖或直接覆盖进行茶园遮荫，而覆盖材料、遮光度、覆盖时间以及生产季节均会影响遮荫的效果和蒸青绿茶的品质［7］。研究表明覆盖遮荫能够通过提高茶叶叶绿素含量而明显改善茶叶色泽，使其更绿［8］。此外，覆盖遮荫还能降低茶多酚含量［9］，改变儿茶素类化合物组成［10］，提高茶树叶片中游离氨基酸的含量［11］。但，只有适度的遮光能促进茶树中氨基酸的积累，但遮光过度不利于氨基酸的积累［12］。一般认为，咖啡碱与氨基酸同属氮代谢，在遮荫过程中的变化趋势与氨基酸变化趋势较为一致。遮荫后茶叶挥发性物质含量和香气种类均明显增加，香气组分得以优化［13］。由于覆盖遮荫对茶叶品质的明显提升作用，可用于夏秋茶品质的改良，从而进一步提高夏秋茶资源的综合利用度。而目前，关于不同生产季节或不同生产月份所制覆盖遮荫蒸青绿茶品质成分的差异尚不明确。

本研究通过测定同一时期遮荫与未遮荫两种栽培措施所制蒸青玉露茶生化成分，以及同一茶树品种在不同生产月份所制蒸青绿茶的生化成分，探讨栽培措施和生产季节对蒸青绿茶主要滋味成分和挥发性物质含量的影响，为蒸青绿茶生产的品质控制提供基础数据，同时为开发夏秋茶资源提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

供试玉露茶（蒸青绿茶）原料采自径山九宇有机茶园。根据同一采摘标准（一芽二叶）和相同覆盖时间（20天），采摘4月覆盖遮荫、5月覆盖遮荫、6月覆盖遮荫、8月覆盖遮荫以及4月未遮荫（对照）的同一茶树品种（鸠坑群体种）鲜叶，经蒸青绿茶生产线制成。甲酸（色谱纯）、没食子酸（GA，≥98%）、没食子儿茶素（GC，≥98%）、表没食子儿茶素（EGC，≥98%）、儿茶素（C，≥98%）、表儿茶素（EC，≥98%）、表没食子儿茶素酸酯（EGCG，≥98%）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG，≥98%）、表儿茶素没食子酸酯（ECG，≥98%）、儿茶素没食子酸酯（CG，≥98%）和咖啡碱（caffeine，≥98%）购自阿拉丁试剂公司（上海，中国）。乙腈（色谱纯）购自Merck公司（达姆施塔特，德国），乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、水合茚三酮、氯化亚锡、碳酸钠、谷氨酸、氯化钠均为分析纯，采购于国药试剂集团化学试剂有限公司（上海，中国）。茶氨酸标准品（Thea，≥99%）购自Sigma公司（圣路易斯，美国）。愈创木酚（guaiacol，≥99%）购自阿拉丁公司（上海，中国）。

1.2 设备

紫外可见分光光度计UV-2800S型（上海尤尼柯仪器有限公司）、LC-20 AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）、QP2010 Ultra气相色谱质谱联用仪（日本岛津公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 茶汤提取方法 将茶样研磨成粉末并过0.45 mm筛，称取150 mg干茶，用25 mL的50%乙醇溶液于70℃浸提20 min。经4500 rpm和4℃离心10 min后，取上清液用于化学成分检测。

1.3.2 茶多酚含量检测 参照GB／T 8313－2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》。

1.3.3 游离氨基酸总含量测定 参照GB／T 8314－2013《茶 游离氨基酸总量测定》。

1.3.4 HPLC法检测儿茶素类化合物和咖啡碱浓度 待测样品在12000 rpm、4℃条件下离心10 min，取上清液用于HPLC检测，具体方法参照已发表文献［14］。HPLC检测条件：安捷伦TC 4.6 mm×250 mm C18色谱柱，柱温33℃，A流动相：乙腈／乙酸／水＝3／0.5／96.5，B流动相：乙腈／乙酸／水＝30／0.5／69.5，洗脱梯度：前35 min内流动相B由20%线性增加至65%，并保持65%B相5 min，40 min后20%B相平衡5 min，进样量10μL，流速1 mL／min，紫外检测波长280 nm。采用外标法进行定量分析。

1.3.5 茶氨酸检测方法 参照GB／T 23193－2017《茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法》。

1.3.6 水浸出物检测方法 参照GB／T 8305－2013《茶 水浸出物测定》。

1.3.7 挥发性物质含量检测方法 采用QP2010 Ultra气相色谱质谱联用仪对挥发性化合物进行分析，具体方法参照已发表文献［15］。茶样研磨后过0.6 mm筛。取1.00 g茶粉样品加入50 mL的去离子水置于70℃提取10 min。冷却至室温后在25℃和8000 rpm条件下离心10 min后取上清液。取10 mL上清液于20 mL顶空瓶中，加入20μL内标愈创木酚（100μg／mL）和2 g烘干后的NaCl，然后立即密封顶空瓶；插入50／30μm固相微萃取吸附纤维头（DVB／CAR／PDMS，思必可有限公司，美国），在40℃下吸附1 h。而后，将固相微萃取吸附头插入250℃的GC-MS进样口中解吸附3.5 min，并按以下条件进行GC-MS分析：色谱柱HP-INNOWax（30 m×0.25 mm，0.25μm，安捷伦公司，美国），载气（氦气，99.999%），流速1.0 mL／min，进样口温度250℃，离子源温度200℃，不分流进样；离子化方式EI，电子能量为70 eV，MS扫描范围35－400 m／z；柱温箱程序为前10 min保持50℃→3℃／min的速度增加到150℃→在150℃维持1 min→以15℃／min的速度增加到230℃→230℃维持3 min。

将化合物的质谱图与NIST质谱库提供的标准质谱图进行比对，参考文献中的相关化合物的保留指数，对挥发性物质进行定性分析。采用内标法（愈创木酚），根据以下公式对各挥发性物质进行相对定量。

1.3.8 数据分析 采用SPSSStatistic软件（IBM公司，美国）进行显著性分析。采用Minitab 19软件（上海泰珂玛信息技术有限公司，中国）进行主成分分析（PCA分析）。图3采用Tbtools［16］软件（华南农业大学，中国）Normalized选项以Scale method进行均一化处理制作热图，其中图A采用列均一化、行聚类分析；图B采用行均一化、列聚类分析。

2 结果与讨论

2.1 覆盖遮荫对蒸青绿茶主要品质成分的影响

表1为覆盖遮荫对蒸青绿茶品质相关指标的影响。4月份，覆盖遮荫和未遮荫（对照）茶样的茶多酚含量分别为151.3 mg GA／g干茶和144.9 mg GA／g干茶，无显著差异。覆盖遮荫茶样的游离氨基酸总含量为64.1 mgThea／g干茶，是对照的2.54倍。可见，覆盖遮荫可以显著提高蒸青绿茶游离氨基酸总含量，但在4月份覆盖遮荫对蒸青绿茶的茶多酚含量影响不显著。该结果与之前报道的覆盖遮荫显著减少春茶茶多酚含量，增加氨基酸含量的结果有所不同［10］，这可能与所采用的茶树品种及制样方法的不同有关。酚氨比值是茶多酚总量与氨基酸总量之比，是反映茶汤滋味的重要指标。酚氨比值较高，茶汤苦涩味较明显。因此，一般认为酚氨比值较低的原料比较适合制作绿茶［17］。如表1所示，4月未遮荫样品的酚氨比值为5.75，而覆盖遮荫蒸青绿茶的酚氨比值为2.36，这主要是由于遮荫样品氨基酸总量的增加，说明覆盖遮荫有助于增强蒸青绿茶的鲜爽度进而提高其品质。特别是，覆盖遮荫蒸青绿茶的茶氨酸含量显著提高，是对照茶样的6.97倍。遮荫样品和对照的水浸出物含量无显著差异，但咖啡碱含量存在显著差异。遮荫样品的咖啡碱含量为19.63 mg／g，显著高于对照的10.93 mg／g。该结果与陆安霞等的研究结果一致［18］，说明适度遮荫能促进茶树叶片生物碱的合成。

表1 覆盖遮荫对蒸青绿茶主要品质相关指标的影响

儿茶素类化合物是茶叶中最重要的多酚组分。表2为覆盖遮荫对蒸青绿茶儿茶素类化合物含量的影响。覆盖遮荫蒸青绿茶的总儿茶素类含量为86.12 mg／g，显著低于对照的95.55 mg／g。可见，遮荫能降低蒸青绿茶总儿茶素类的含量，这主要由于非酯型儿茶素EGC、GC和EC含量的下降。孙京京等发现遮荫处理能够明显降低春季绿茶EGC、EC的含量，而EGCG含量略有上升［10］。

表2 覆盖遮荫对蒸青绿茶儿茶素类化合物含量的影响（mg／g）

2.2 不同生产时间对覆盖遮荫蒸青绿茶主要呈味物质的影响

不同生产时间覆盖遮荫蒸青绿茶的茶多酚含量和游离氨基酸总含量变化如图1（A）所示。其中，8月所制蒸青绿茶的茶多酚含量最高，为166.9 mg没食子酸（GA）／g，显著高于4月、5月和6月所制样品；而4月、5月和6月所制蒸青绿茶样品的茶多酚含量没有显著差异，约为160 mg GA／g干茶。从4月至8月，所制茶样的游离氨基酸总含量从4月份的64.1mg Thea／g干茶下降到8月份的27.0 mg Thea／g干茶，呈现明显的下降趋势。可见，虽然覆盖遮荫对蒸青绿茶的氨基酸总含量有明显提升作用，但来自生产季节的影响仍非常显著，夏秋季所生产的蒸青绿茶游离氨基酸总含量明显低于春季蒸青绿茶。图1（B）为不同时间所制蒸青绿茶的酚氨比值。从4月至8月，蒸青绿茶的酚氨比值从2.36逐渐上升至6.17，这主要是由于游离氨基酸总含量的显著下降。从滋味品质成分的角度来看，夏秋季节生产的覆盖遮荫蒸青绿茶滋味品质不如春季所制茶样。

图1 不同月份所制覆盖遮荫蒸青绿茶的茶多酚、游离氨基酸含量（A）和酚氨比值（B）

表3为不同月份所制覆盖遮荫蒸青绿茶的儿茶素类化合物含量。可见，4月所制蒸青绿茶总儿茶素类含量为86.12mg／g，显著低于5月、6月、8月所制茶样（102.56～113.15 mg／g），且8月份所制茶样的总儿茶素类含量最高。这说明夏秋季节覆盖遮荫蒸青绿茶的总儿茶素类含量较春季样品高，这与茶多酚含量变化趋势整体一致。从4月到8月，所制覆盖遮荫蒸青绿茶样品中表型儿茶素类总含量呈现整体上升趋势；而非表型儿茶素类总含量变化不大。不同月份所制蒸青绿茶的没食子酸儿茶素类含量介于64.65～89.18 mg／g，在夏秋季达到较高水平，而非没食子酸儿茶素类含量稳定在21.24～23.98 mg／g，受生产季节的影响较小。夏秋季节覆盖遮荫蒸青绿茶中表型儿茶素类和没食子酸儿茶素类含量明显增加，这主要是由于EGC和EGCG含量的增加。

表3 不同月份所制覆盖遮荫蒸青绿茶的儿茶素类化合物含量（mg／g）

基于8种儿茶素类化合物含量、茶多酚、游离氨基酸含量和酚氨比值，采用PCA法分析不同月份所生产的蒸青绿茶样品差异，结果如图2所示。第一主成分和第二主成分方差之和占总方差的80.7%，说明PCA分析结果能较好地反映样品信息。得分图（图2A）显示同一月份生产的蒸青绿茶样品能较好地聚集在一起，且与其他月份生产的样品区别开。其中，4月、5月和6月所制覆盖遮荫蒸青绿茶位于第一主成分的正值区段，显著区别于对照和8月所制覆盖遮荫样品（位于第一主成分的负值区段）。而5月、6月、8月所制覆盖遮荫蒸青绿茶位于第二主成分的正值或接近于0值处，而对照和4月所制覆盖遮荫样品位于第二主成分的负值区段，说明第二主成分主要体现了生产月份对蒸青茶样品的影响。结合负载图来看（图2B），对照和8月份所制样品的EGC、EC以及酚氨比值明显高于4月、5月和6月所制蒸青绿茶样品，这是对照和8月份所制样品区别于其他样品的特征指标；对照和4月份所制样品的游离氨基酸总含量显著高于其他月份所制样品，而儿茶素类等含量相对较低，这是对照和4月份所制样品区别于其他样品的主要原因。可见，生产季节对茶样的氨基酸含量有显著影响，对儿茶素类含量有一定的影响，而覆盖遮荫在原有的基础上进一步提高茶样氨基酸的含量。

图2 PCA法分析不同蒸青绿茶样品的得分图（A）和负载图（B）

2.3 覆盖遮荫对蒸青绿茶挥发性物质的影响

通过GC-MS分析，在五个茶叶样品中共检测到61种挥发性香气物质，包括14种醇类物质、13种醛类物质、11种酮类物质、5种酯类物质、6种酸类物质和12种其他类物质。在所检测的蒸青绿茶样品中，醛、酮类物质的相对含量占总挥发性物质含量的60%以上，尤以醛类物质含量最高。香气物质组成中醛类和醇类物质含量较高，占据主导地位，使得蒸青绿茶具有较强的青草味和香气鲜、爽的特征［19］；呋喃、吡咯和吡嗪类等美拉德反应产物含量较低，烘焙香不明显。图3为不同月份蒸青绿茶样品含有的61种挥发性物质含量的聚类热图。对各挥发性物质组分进行列均一化处理，如图3A所示，各蒸青绿茶样品的挥发性物质组成较为接近。（E，E）-2，4-庚二烯醛［（2E，4E）-hepta-2，4-dienal］和正己醛（hexanal）为最主要的挥发性物质，均属于醛类物质；含量较高的酮类化合物有（3E，5E）-辛-3，5-二烯-2-酮［（3E，5E）-octa-3，5-dien-2-one］，和β-紫罗兰酮［（E）-4-（2，6，6-trimethylcyclohexen-1-yl）but-3-en-2-one］；最主要的醇类化合物有芳樟醇（3，7-dimethylocta-1，6-dien-3-ol）和1-辛烯-3-醇（oct-1-en-3-ol）；另有含量较高的酯类化合物水杨酸甲酯（diethyl benzene-1，2-dicarboxylate），酸类化合物月桂酸（dodecanoic acid），以及3种其他类化合物奥苷菊环（azulene）、吲哚（1H-indole）和1，2，4，5-四甲苯（1，2，4，5-tetramethylbenzene）。对所有样品进行聚类分析，结果表明4月份覆盖遮荫蒸青绿茶的香气组成能明显区别于其他样品（图3 A）。随着生产月份的往后推移，样品的香气组成逐渐与未遮荫样品接近：8月覆盖遮荫的绿茶的香气物质组成与4月份未经遮荫覆盖的最接近；而6月覆盖遮荫的香气，则与上述（8月覆盖遮荫和4月份未遮荫覆盖）的绿茶香气比较接近。可见，覆盖遮荫可以改变蒸青绿茶的挥发性物质组成，在一定程度上影响蒸青绿茶的香气。有报道认为进行遮荫覆盖后的蒸青绿茶具有海苔香［20］。随着进入夏秋季节，环境光照强度增强，覆盖遮荫对香气组成的影响逐步削弱，因而夏秋季（6月、8月）覆盖遮荫所制蒸青绿茶的挥发性物质组成与4月份未采取遮荫的样品组成接近，主要特征为（E，E）-2，4-庚二烯醛较正己醛占比高，这与4月份覆盖遮荫所制茶样正好相反，而5月份覆盖遮荫所制茶样具有过渡特征，（E，E）-2，4-庚二烯醛和己醛的占比相当。对各挥发性物质组分进行行均一化处理，比较不同样品间特定化合物含量的高低。如图3（B）所示，4月份和5月份覆盖遮荫蒸青绿茶的挥发性物质总含量较高，然后依次是8月、6月所制覆盖遮荫茶样和4月未遮荫茶样（对照），后三个茶样的挥发性物质总含量差异不明显。从不同茶样的挥发性物质的变化规律来看，挥发性物质的变化趋势主要分为两大类，4月和5月覆盖遮荫蒸青绿茶含量高而对照组含量低的挥发性物质，以及对照组中含量相对更高而4月、5月遮荫蒸青绿茶中含量低的挥发性物质。总的来说，覆盖遮荫后茶样的最主要挥发性物质（E，E）-2，4-庚二烯醛和正己醛占比变化，以及（E，E）-2，4-庚二烯醛、吲哚、正己醛、β-紫罗酮和芳樟醇含量的提高，可能是形成覆盖遮荫蒸青茶样特征香型的主要物质基础。有研究报道，（E，E）-2，4-庚二烯醛与茶叶的油脂味、坚果香有关［21－22］；低浓度吲哚具有花香味［23］。正己醛具有生的油脂、青草气以及苹果香味特征，β-紫罗酮具有强烈的紫罗兰香味，芳樟醇具有花果香和铃兰香，是高级绿茶最重要的香气成分之一［24－26］。

图3 不同月份所制蒸青绿茶挥发性物质含量的列均一化热图（A）和行均一化热图（B）

3 结论与展望

本文研究了覆盖遮荫处理以及生产季节对蒸青绿茶主要品质成分的影响，包括茶多酚、游离氨基酸总含量、水浸出物、茶氨酸、咖啡碱、儿茶素类化合物和挥发性物质含量。结果表明，覆盖遮荫能显著提高蒸青绿茶游离氨基酸总含量，特别是茶氨酸的含量，对茶多酚含量影响不明显，酚氨比值显著降低，蒸青绿茶滋味品质有所提高；就挥发性物质而言，覆盖遮荫有助于提高蒸青绿茶挥发性物质总量，特征香气组分为（E，E）-2，4-庚二烯醛、正己醛、β-紫罗酮、吲哚和芳樟醇。生产季节对覆盖蒸青绿茶的品质成分有显著影响，主要体现在随着生产时间从4月份到8月份，游离氨基酸总含量呈明显下降趋势，而茶多酚含量略提高，酚氨比值大幅上升，5月所制蒸青绿茶的挥发性物质总含量较4月略高，4月和5月所制蒸青绿茶的挥发性物质明显高于8月所制茶样，6月所制茶样的挥发性物质含量最低，与对照茶样无显著差异。PCA主成分分析结果表明，蒸青绿茶茶样可根据儿茶素类组分、茶多酚、游离氨基酸总含量以及酚氨比值进行有效区分。总的来说，4月份所制遮荫覆盖蒸青绿茶的氨基酸含量高，多酚含量相对较低，因而比5－8月份所制蒸青绿茶的口感更为鲜爽；而5月、8月所制遮荫覆盖蒸青绿茶的挥发性物质含量较高，且5月所制蒸青绿茶的滋味尚可，可利用5月、8月蒸青绿茶挥发性香气物质相对丰富的特性制作相应的调味茶饮料、茶食品或含茶日化产品等。根据所开发产品的特质，如偏重口感或偏重香气，选择合适的生产季节的蒸青绿茶作为原料，实现茶资源的高效利用。