薄膜过滤法和直接接种法在口罩无菌检测中的应用比较

郭文琴 杨丹

摘要：目的：比较盐酸氯丙嗓注射液的无菌检查方法，采用直接接种法和薄膜过滤法，进行无菌检查。结果：直接接枝法更易受污染，控制周期更长，薄膜过滤法更短，效率更高。结论：薄膜过滤法更容易操作，污染更小，寿命短。

关键词：盐酸氯丙嗓注射液;薄膜过滤法;无菌检查

1 引言

根据2020版中国药典规定，氯化物盐酸盐的灭菌监测表明，盐酸氯丙嗓注射液通过直接注射产生的一段时间，3天后会出现浑浊。3 天如果按照药剂师的规则，它是需要更换种子或染色剂和显微镜后确认结果。观察明确的培养基，便于判断测试结果，监测周期短。作者比较了监测两种方法的效果，报告如下。《中国药》2000年版规定注射剂的无菌检查有直接接种法与薄膜过滤法。一般小容量注射剂采用直接接种法，大容量注射剂采用薄膜过滤法。随着科学技术的进步，抑菌剂的发展和一次性加热系统（抑菌剂）的改进，使得膜过滤器的操作更加容易，应用也更加广泛。本文以1%的地卡因注射剂和10%的普鲁卡因注射剂为例，讨论小剂量膜过滤的可能性，并与直接注射进行比较。

2 仪器与试药、菌株

HTY-2000智能细菌收集器和全放电细菌收集器（杭州医疗器械厂）。盐酸氯丙嗓注射液无锡制药厂，规格为2m。剂量为50mg，批号为0501020。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色梭状芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉 LCMCC。液體容器硫乙醇酸盐改变培养基军事培养基，营养培养基增加培养基，钠不透明培养基，营养培养基改良。冲洗液为氯化钠蛋白陈缓冲液培养基，pH=7.0，按参考方法配制，高压蒸汽灭菌。细菌收集器HTY-2000型Py 220型全封闭细菌提取器（杭州古鼎医疗设备有限公司）标准SW-Cy-IB卫生座（100级苏州周加工设备厂）MJ 160。MJ-160L型霉菌培养箱（上海华联环境试验设备公司），PYX- DHS隔水式电热恒温培养箱（上海市医疗器械批发部）。

注射用盐酸100种（10米1/瓶）（我院生产批号：030103.030429.031029）氯化氢注射装置100支（10毫升/瓶）（批号：30 30307.03 0513.国产）03103液体液液体硫乙醇酸盐培养基。薄膜过滤法：取10瓶10%的过氧化氢，每批号注入10%，收集培养基。通过放置在防霉、防水培养箱中并在特定温度下生长的杀菌收集器，将每个100m1盐酸普鲁卡因注射液泵入各自的细菌收集器。每天，是否有细菌滋生。另取一管空容器，直接配制金黄色葡萄球菌 lmb 溶液作为阳性试验。直接注射法：按规定，取上述批号的10a盐酸地卡因注射液、1000盐酸普鲁卡因注射液，用无菌注射器直接取样，分别接种到液体硫乙醇酸盐培养基管（需氧培养基管、厌氧培养基管）和霉菌培养基管中，并作阳性对照管（同“薄膜过滤法”）进行培养、观察和记录。

3 方法与结果

3.1 试验菌液的制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物引入培养液中，30-35℃培养16-18小时，用0.9%氯化钠溶液溶解，得到两位数的溶液，少计数的营养素，超过 100 摄氏度。将新鲜培养的氯化氯化藻放入液体巯基乙酸盐中，30-35℃培养16-18h，使用0.9%醋酸氯溶液，氯化钠溶液小于100cc/mL并在容器中计数。将新鲜培养的白色念珠菌加入改良马提尼酒中，20-25℃放置48小时，使用0.将 9% 氯化钠溶液稀释至 100 cfu/ml 以下并用玫瑰珠计数。双阿迪克钠法）取新鲜培养的阿司匹林甘油加入改良的Martin Adaga梯度中，20-25℃培养7天，加入4ml 0.9%氯化钠溶液，用氯化钠溶液洗去气泡。氯化物0.9%用小于 100 C/m2 的氯化钠和双马丁等离子体。

3.2 培养基的灵敏度和无菌检查

取 13 管巯基乙酸盐，每管体积为 12 毫升，吸入 2 管金黄色葡萄球菌，培养3天，以每管9毫升的剂量服用9片马丁片，并注射2片LBD bin和2片浓缩咖啡，每片小于100 cfu / ml。不是设计为不育控制的空控制器和 SD 培养。每天观察结果，如果有细菌的培养基管生长良好，空对照管生长相同，则判断培养基的敏感性和无菌性。

3.3 直接接种法

取供试品的H型管，用六种巯基乙酸盐液制成供试品，其中一根注射管每米吸收50-100个葡萄球菌作为阳性试验。轻轻摇动使供试品与培养基混合，将测试产品与容器混合。根据需要培养 14 天后，将适当数量的培养物转移到培养基中，以恢复细菌培养（2 天、3 天），并观察结果，结果如表1所示。

3.4 薄膜过滤法

将待测样品用少量洗涤液浸湿至滤膜，加入待测样品至内含一次性周围细菌并排干。用流水冲洗，在 100 ml 试管中加入 100 ml 硫乙醇酸盐液体培养基溶液。将 1 ml 金黄色葡萄球菌肉汤加入一个管中，然后将 100 ml 真菌培养基加入另一个在 30-35 度下孵育的管中。真菌在20-25°C的温度下生长，14天后观察结果，在此期间每天观察细菌生长。取涡轮培养液转入惰性液后，出现湍流，染色及镜检结果为无菌。分子过滤法 膜过滤法2个品种一次3次，共6个样品在规定条件下培养7天，每天无细菌生长。阳性试管为（+），符合要求，应为无菌检查合格。

3.5 口罩无菌检测方法

在我国医用口罩执行标准中，有GB19083-2010《医用防护口罩技术要求》、YY0469-2011《医用外科口罩》和YY/T0969-2013《一次性使用医用口罩》。对此，需要理化指标检测仪器、环氧乙烷残留检测仪器及微生物指标检测仪器。在上述三个标准中，对于微生物指标检测执行GB/T15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》附录B–产品微生物检测方法和GB/T14233.2-2005《 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法》第3章–无菌试验。

B1  产品采集与样品处理于同一批 号的 二个运输包装中至少抽取 12个蕞小销售包装样品，1/4样品用于检测，1/4样品用于留样，另 1/2样品（可就地封存）必要时用于复检。抽样的蕞小销售包装不应有破裂，检验前不得启开。在100级净化条件下用无菌方法打开用于检测的至少 3个包装，从每个包装中取样，准确称取10g±1g样品。剪碎后加人到200ml灭菌生理盐水中，充分混匀，得到一个生理盐水样液。液体产品用原液直接做样液。如被检样品含有大量吸水树脂材料而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按每次 50ml递增，直至能吸出足够测试用样液。在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时相应调整稀释度。

B2  细菌菌落总数与初始污染菌检测方法

本方法适用于产品初始污染菌与细菌菌落总数（以下统称为细菌菌落总数）检测。

B2.1 操作步骤

待上述生理盐水样液自然沉降后取上清液作菌落计数。共接种 5个平皿，每个平皿中加人 1ml样液，然后用冷却至45℃左右的熔化的营养琼脂培养基 15～20ml倒人每个平皿内混合均匀 。待琼脂凝固后翻转平皿置 35℃±2℃培养 48h后，计算平板上的菌落数。

B2.2 结果报告

菌落呈片状生长的平板不宜采用;计数符合要求的平板上的菌落，按式（B1）计算结果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–细菌菌落总数 cfu/g或cfu/mL;

A——5块营养琼脂培養基平板上的细菌菌落总数;

K——稀释度。

当菌落数在 100以内，按实有数报告，大于 100时采用二位有效数字。

如果样品菌落总数超过本标准的规定，按 B2.3进行复检和结果报告。

B2.3 复检方法

将留存的复检样品依前法复测 2次，2次结果平均值都达到本标准的规定，则判定被检样品合格;其中有任何 1次结果平均值超过本标准规定，则判定被检样品不合格。

B3  大肠菌群检测方法

B3.1 操作步骤

取样液 5ml接种 50ml，乳糖胆盐发酵管，置 35℃±2℃培养 24h，如不产酸也不产气，则报告为大肠菌群阴性。如产酸产气，则划线接种伊红美蓝琼脂平板，置35℃±2℃培养 18～24h，观察平板上菌落形态。典型的大肠菌落为黑紫色或红紫色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽，也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉红色，中心较深的菌落。

取疑似菌落 1-2个作革兰氏染色镜检，同时接种乳糖发醉管，置 35℃±2℃培养 24h，观察产气情况。

B3.2 结果报告

凡乳糖胆盐发酵骨产酸产气，乳糖发酵管产酸产气，在伊红美蓝平板上有典型大肠菌落，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，可报告被检样品检出大肠杆菌。

B4  绿脓杆菌检测方法

B4.1 操作步骤

取样液 5ml，加人到50ml SCDLP培养液中，充分混匀，置 35℃±2℃培养 18～24h。如有绿脓杆菌生长，培养液农面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化胺琼脂平板，置 35℃±2℃ 培养 18～24h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。

取可疑菌落涂片作革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性菌者应进行下列试验：

氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基对苯二胺试液，30s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性。

绿脓菌素试验：取2-3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面，35℃±2℃培养24h，加入 3～5ml，充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解，待三-氯-甲-烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加人 1mol/L的盐酸1mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。

3.6 直接接种法

用上述条件下的6份检品，经过7天的培养和观察，栽培品种的栽培品种没有生长。研究薄膜过滤法，分析是否符合规定，应足以控制无菌检查合格。

4 结论

由表1可以看出，对同一试品采用直接接种法控制周期延长，采用膜过滤法缩短了控制周期并进行了优化。有的试品与培养基混合后会出现混乱，影响结果的判断。薄膜过滤法可以克服直接嫁接法栽培延迟的缺点，特别是换种时缺乏增加污染的机会，本实验证明，小容量注射剂也可以采用薄膜过滤法进行无菌检查。

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