中生菌素对杨树烂皮病的抑菌机制初报

矫丽曼

(辽宁省杨树研究所,辽宁 盖州 115213)

杨树具有生长快、抗逆性强、轮伐期短、产量高、易于更新等特点，作为主要造林树种在辽宁省内广泛栽培[1]。但一些地区不能做到合理造林、生态功能减退、病虫害防治技术缺乏等原因致使杨树病虫害发生严重，给林业生产造成巨大损伤，威胁着杨树产业的发展[2-3]。

杨树烂皮病又称腐烂病，病原有性阶段为污黑腐皮壳(ValsasordidaNit.)，无性阶段为金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma(Pers.) Fr.)[3]。通常分为枝枯型和干腐型。枝枯型主要发生在苗木、幼树及大树的枝条，发病初期病斑呈暗灰色，后期散生许多黑色小点，分生孢子器[4-5]；干腐型主要发生于主干、大枝和分杈处，发病初期病斑呈暗褐色、水渍状，后期在病斑上长出许多针状黑色小突起，即分生孢子器。烂皮病是杨树重要的枝干病害之一[6]，如发生日灼、冻害、干旱等不利于杨树生长环境条件，就会引起杨树干部创伤、树势衰弱、烂皮病大面积发生，导致被害树木树势衰弱，甚至枯死，严重时造成杨树大片死亡[7-8]。

杨树烂皮病常采用化学农药防治，但化学农药的过度使用造成了很多负面影响，如破坏生态平衡、产生抗药性等。如何安全有效地使用生物农药，一直是林业工作者研究的热点问题。研究选用了一种新型生物发酵杀菌剂中生菌素，初探其对杨树烂皮病病原菌的抑菌机制，为杨树烂皮病病害科学防治提供一定的理论基础。

1 试验材料

1.1 菌株

杨树烂皮病(88513)，购自中国林业科学院林业菌种保存中心。

1.2 药剂

有效成分含量3%中生菌素(江西正邦作物保护有限公司)，考马斯亮蓝G-250(国药集团化学试剂有限公司)，牛血清白蛋白(BioFroxx)，丙二醛试剂盒(南京建成A003-2)。

2 试验方法

2.1 中生菌素对杨树烂皮病菌丝生长及生物量的影响

根据药剂使用说明书用量配成多个梯度浓度的溶液，在无菌条件下，加入到未凝固的PDA固体培养基中，使药剂在培养基中的最终稀释400、600、800、1000倍液，倒入无菌平皿中。用直径5 mm无菌打孔器在预先培养好的杨树烂皮病病原菌菌丝平面上打孔，待培养基冷却后用无菌镊子夹取一片圆形菌丝片接种于培养基中央，用封口膜封好，放置于25 ℃生化培养箱中，倒立暗培养，同时以加无菌水的培养基作对照，每处理5次重复。采用十字交叉法每隔12 h观察并测定菌丝生长的直径，取各处理的平均值[9-10]。

将PDA液体培养基等量分装于大三角瓶中，灭菌待冷却后在无菌条件下加入不同质量的中生菌素药剂，使药剂在液体培养基中最终稀释400、600、800、1000倍液，再接入直径5 mm的菌丝片，放置于25 ℃摇床中培养。以不加药剂为对照组，当对照组长满整个培养基时，终止培养，取出菌丝用无菌蒸馏水冲洗干净，用8层纱布过滤拧干，冷冻干燥后称量干重[11-12]。

2.2 中生菌素对杨树烂皮病菌丝内可溶性蛋白质含量的影响

以牛血清白蛋白为蛋白标准品，采用考马斯亮蓝G-250染色法测定菌丝内可溶性蛋白质含量[13]。取各处理干菌丝100 mg放于无菌研钵中，迅速加液氮研磨成粉末，然后用预冷生理盐水稀释至10 mL，取样品液0.1 mL，加入去离子水0.9 mL，再加入考马斯亮蓝溶液5mL，混匀后放置2 min，以加等量无菌去离子水为对照，每个处理3次重复。以对照管调零，测量各样品OD595nm,并通过蛋白标准曲线计算样品蛋白含量[14-15]。

2.3 中生菌素对杨树烂皮病菌菌丝体内丙二醛(MDA)含量的影响

MDA含量测定采用TBA法。取各处理干菌丝100 mg，放于冷冻研钵中加液氮低温研磨成粉末，用预冷生理盐水溶液稀释至10 mL,2500 r/min 4 ℃超低温离心5 min，取上清液按照南京建成A003-1试剂盒说明书进行菌丝体内丙二醛含量的测定[16-17]。

3 结果与分析

3.1 中生菌素对杨树烂皮病菌菌丝生长及生物量的影响

杨树烂皮病病原菌生长缓慢。当培养10 d时，对照菌丝已延伸至平皿边缘，且菌丝为白色，未产生孢子；而在含中生菌素各培养基中菌丝向外延伸很小，且菌丝均为白色。各处理菌丝生长抑制率见表1。当中生菌素稀释倍数小于800倍液时，抑菌率大于85%，且各处理菌丝生长直径在P<0.05水平上存在显著性差异，抑菌率也存在显著性差异。可见随着中生菌素药剂稀释倍数的减小，抑制率逐渐增大。

杨树烂皮病菌在液体培养基中培养12 d时，对照组菌丝已长满整个液体发酵培养基。结果如表1，对照组100 mL发酵液中菌丝干重为(74.78±1.24) mg，而处理组菌丝干重明显低于对照组，800倍稀释液处理组100 mL发酵液的菌丝干重为(7.99±0.98) mg，而400倍稀释液的为(2.97±0.49) mg。可见不同稀释倍数中生菌素对杨树烂皮病菌丝生长及生物量都有影响，能显著抑制菌丝的生长。

表1 中生菌素对杨树烂皮病菌菌丝生长及生物量的抑制作用

3.2 中生菌素对杨树烂皮病菌丝体内可溶性蛋白质含量的影响

以牛血清白蛋白为标准样品绘制蛋白质标准曲线，结果见图1，蛋白质含量(Y)与吸光值(x)的回归方程为：Y=0.0066x +0.0123，相关系数R2=0.9989。根据试验测得的各处理吸光值(OD595)计算出相应的蛋白质含量。如图2，培养10 d后，对照菌丝体内可溶性蛋白质含量为(6.48±1.05) μg/mL，处理组的可溶性蛋白质含量明显低于对照组，800倍稀释液的处理组菌丝体内可溶性蛋白质含量为(0.81±0.16) μg/mL，并随着稀释倍数减小菌丝体内可溶性蛋白质含量也随之减少。可见中生菌素能明显抑制杨树烂皮病菌丝体内可溶性蛋白质合成，导致可溶性蛋白质含量降低。

图1 蛋白T质标准曲线

各柱形图上的小写字母表示差异显著性水平(P<0.05)

3.3 中生菌素对杨树烂皮病菌丝体内丙二醛(MDA)含量的影响

结果如图3，当培养10 d后，对照组菌丝体内丙二醛含量为(1.18±0.18) mmol/g，800倍稀释液的处理组菌丝体内丙二醛含量为(2.03±0.23) mmol/g，而400倍稀释液的处理组菌丝体内丙二醛含量为(2.67±0.30) mmol/g，并在P<0.05水平上存在显著性差异。可见中生菌素药剂处理组菌丝体内丙二醛的含量明显高于对照组，表明菌丝细胞在受到药剂胁迫时，细胞膜受到破坏，膜脂化加剧，产生大量的MDA。

各柱形图上的小写字母表示差异显著性水平(P<0.05)

4 结论与讨论

初步报道了中生菌素对杨树烂皮病的抑菌机制，主要从对菌丝生长和生物量的影响及对菌丝体内可溶性蛋白质和丙二醛含量四个方面进行了研究。初步确定中生菌素对杨树烂皮病菌丝生长及生物量有明显的抑制作用；能显著抑制杨树烂皮病菌丝体内可溶性蛋白质合成，导致体内蛋白质含量降低；并对菌丝细胞有很大破坏作用，细胞膜脂质过氧化程度增大，细胞受损严重，导致丙二醛含量增大。

中生菌素是一种新型农用抗生素、较广的保护型杀菌剂。本文仅从几个方面进行了抑菌机制研究，在今后试验中，还应该从抑制菌丝体内各种合成和代谢酶活性等方面进行更深层次的研究，较详细分析中生菌素的抑菌机理。通过试验证实中生菌素对杨树烂皮病有较好的抑制效果，可以应用于林业真菌性病害的防治，为林业病害科学防治提供一定的理论依据。