香菇柄多糖的提取纯化及抗氧化活性研究

陈 平 江崇弘

（1、南阳理工学院生物与化学工程学院，河南 南阳473000 2、河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473000）

香菇为真菌植物门真菌香蕈的子实体，属担子菌纲伞菌科，是世界上著名的食用菌之一，且具有较高的药用价值[1]。香菇多糖为香菇提取物中最重要的活性成分之一，在调控机体免疫，抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等方面的作用显著[2-4]，相关研究受到越来越多人的关注。有研究指出香菇多糖的分子量和纯度与其功能密切相关。香菇多糖本身为一种复杂的生物大分子，大大增加了其提取纯化的难度，进而限制了香菇多糖功效的发挥、构效关系以及作用机制的研究。目前用于香菇多糖提取的方法主要有热水浸提、酸提法、酶提法、微波辅助法、超声辅助法等[5]，这些方法所得多糖多为粗多糖。香菇柄是香菇采收过程中的副产物，产量大，价格便宜，主要用于加工生产香菇酱、饲料等低附加值产品，鉴于香菇柄中的营养成分近似于香菇伞，且多糖亦为其主要活性成分，故对香菇柄进行深加工和综合利用具有重要的现实意义[6]。本文以香菇柄为原料，利用水溶液浸提法提取香菇柄中的多糖后，联合柱层析法对提取的粗多糖进纯化，并就纯化所得多糖的抗氧化活性进行初步研究，以期为香菇柄中多糖的开发利用提供基础数据和理论依据。

1 实验材料与方法

1.1 材料。香菇，购自市内万德隆超市。

1.2 主要试剂。浓硫酸、苯酚、无水乙醇、过硫酸钾、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、盐酸、碳酸氢钠等试剂均为分析纯。G-150 葡聚糖凝胶：上海伊卡生物科技有限公司；DEAE——52 纤维素和DPPH：福州飞净生物科技有限公司；ABTS/ABTS 底物：上海士锋生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备。小型粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；电热鼓风干燥箱、电热恒温水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司；紫外可见光分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；低速离心机：上海安亭科学仪器厂；恒流泵层析柱：上海夏美生化发展有限公司。

1.4 实验方法。1.4.1 香菇柄多糖的提取。购买的香菇取柄，用清水洗净表面的泥土，撕碎，在45℃下进行低温烘干，粉碎，过40 目筛，称取适量置于500mL 圆底烧瓶中，按照1:40（香菇柄：水）质量体积比加入蒸馏水混匀后放入水浴锅中，在85℃的条件下浸提3h，抽滤后得滤液，对所得滤液进行减压浓缩至一定体积后，加入适量无水乙醇，使样品中无水乙醇浓度至90%，搅拌均匀后，4℃过夜，取出样品离心收集沉淀，并用无水乙醇洗涤絮凝物沉淀3 次，将所得絮凝物在60℃真空干燥烘干至恒重得香菇柄粗多糖。1.4.2 香菇柄多糖含量的测定。多糖含量测定采用苯酚硫酸法，具体步骤参考文献[7]。1.4.3 香菇柄多糖的纯化。1.4.3.1 香菇柄多糖DEAE-52 纤维素离子交换层析对于粗多糖初步纯化采用DEAE-52 纤维素离子交换层析，具体实验步骤参考文献[8]。准确称取热水提取法得到的粗多糖50mg 加5mL 蒸馏水溶解，4000r/min 离心10min，制成10mg/mL的多糖溶液，过0.45μm 滤膜后上样，依次用蒸馏水、0.2mol/mL、0.4mol/mL NaCl，以1mL/min的洗脱速度洗脱，洗脱体积约100mL，收集洗脱液。并用苯酚硫酸法测其在490nm 波长下的吸光值，根据吸光值绘制洗脱曲线。1.4.3.2 香菇柄多糖葡聚糖凝胶过滤层析。为得到均一性多糖，将离子交换层析纯化所得多糖采用G-150 凝胶过滤层析进一步纯化，具体实验步骤参考文献[9]。准确称取经离子交换层析初步纯化得到的多糖20mg 加2mL 蒸馏水溶解，4000 r/min 离心10min，制成10mg/mL的多糖溶液，0.45μm 滤膜过滤后上样。用蒸馏水进行洗脱，洗脱速度为0.2mL/min，收集洗脱液并用苯酚硫酸法测其在490nm 波长下的吸光值，根据吸光值绘制洗脱曲线，收集主要组分浓缩到原来体积的1/4。用蒸馏水透析24h，干燥至恒重后用于后续活性分析。1.4.4 香菇柄多糖抗氧化活性的测定。1.4.4.1 香菇柄多糖DPPH 自由基清除实验[10]。准确称取纯化制备的香菇柄多糖用蒸馏水配制浓度分别为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的多糖溶液待测，取3mL 多糖待测液与3mL 浓度为0.08mg/mL的DPPH 溶液混匀，放置2min，用无水乙醇做空白对照，测其517nm 下的吸光值（A1）；3mL 蒸馏水与3mLDPPH 所测吸光值为A2；3mL 多糖待测液与3mL 蒸馏水所测吸光值为A3；根据公式DPPH 自由基清除率=[1-(A3-A1)/A2]*100%计算香菇柄多糖的DPPH 清除率。1.4.4.2 香菇柄多糖ABTS 自由基抑制实验[11]。取3mL 多糖待测液与5mLABTS 工作液摇匀，放置5min，用蒸馏水做空白对照，测其734nm 下的吸光值（A1′）；3mL 蒸馏水与5mL ABTS 工作液所测吸光值为A2′；3mL 蒸馏水与5mL 蒸馏水所测吸光值为A3′；根据公式抑制率=[1-(A3′-A1′)/A2′]*100%计算ABTS 自由基抑制率。

2 结果与分析

2.1 香菇柄多糖的提取结果。采用热水提取对香菇柄中粗多糖进行提取后按照1:4的体积比加入无水乙醇对粗多糖浓缩液进行醇沉，可得到0.43g 多糖，得率为4.3%，即43mg/g。

2.2 香菇柄多糖的纯化结果。2.2.1 DEAE-52 纤维素离子交换层析结果。将DEAE-52 纤维素离子交换层析收集到的各管洗脱液，在490nm 波长下测其吸光值，以洗脱液体积为横坐标，吸光值为纵坐标绘制洗脱曲线如图1 所示。可见经过不同的洗脱液洗脱后，可得到一个明显的峰。收集该峰对应的洗脱液，经旋转蒸发浓缩至收集液原始体积的1/4 后醇沉后离心取下层沉淀，将沉淀干燥即得到经DEAE-52 纤维素纯化得到的多糖，称重得其质量为35mg，计算粗多糖经初步纯化得率为70%，即香菇柄多糖得率3.01%。2.2.2 G-150 葡聚糖凝胶层析结果。将G-150 葡聚糖凝胶层析收集到的各管洗脱液在490nm 波长下测其吸光值并绘制洗脱曲线，结果如图2 所示，经洗脱可得到一个明显的峰，收集该峰对应的洗脱液，旋转蒸发浓缩至收集液原始体积的1/4 后醇沉干燥即得到经凝胶过滤层析纯化得到的多糖，称重得其质量为15mg，计算初步纯化的多糖经二次纯化后得率为75%。联合使用DEAE-52 纤维素离子交换层析和G-150 凝胶过滤层析对粗多糖进行纯化结果可知每50mg 粗多糖纯化后可获得26.25mg的纯多糖，最终多糖的纯化得率为52.5%，即香菇柄多糖得率为2.26%。

图1 DEAE-52 纤维素离子交换层析洗脱曲线

图2 G-150 凝胶过滤层析洗脱曲线

2.3 香菇柄多糖抗氧化活性测定结果。2.3.1 香菇柄多糖对DPPH 自由基的清除效果。将纯化所得多糖分别配制成浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的 多 糖 溶液，测得的DPPH 自由基清除率如图3 所示，由图可知香菇柄多糖DPPH 自由基清除率同阳性对照Vc 一样均随着待测样本浓度的增加而逐渐增大，说明该多糖与DPPH的清除率存在较好的量效关系。其中香菇柄多糖的DPPH 自由基清除能力由0.2mg/mL的23.21%增加至浓度为1mg/mL的39.24%。2.3.2 香菇柄多糖对ABTS 自由基的清除效果。香菇柄多糖对ABTS 自由基的清除效果如图4 所示，由图可知香菇柄多糖ABTS 自由基清除率同阳性对照Vc 一样均随着待测样本浓度的增加而逐渐增大，其中香菇柄多糖的ABTS 自由基清除能力由19.25%增加至33.45%。结合两者之间清除率的具体数据可知虽然香菇柄中的多糖对DPPH的清除能力与Vc 存在一定差距，但仍表现出一定的抗氧化活性。

图3 香菇柄多糖对DPPH 自由基的清除能力

图4 香菇柄多糖对ABTS+自由基的清除能力

3 结论

利用热水提取法和柱层析法对香菇中多糖进行提取纯化，并对所得多糖的活性进行初步探索，最终香菇柄多糖得率可达2.26%。文中香菇柄多糖的提取纯化方法和数据为相关多糖的制备提供了参考。由于多糖结构复杂，纯化所得多糖的具体结构的解析是后续的研究方向之一。另外纯化后的多糖表现出一定的DPPH 自由基和ABTS 自由基清除能力，且两种自由基的清除效果与多糖浓度成较好的线性关系，可进一步从生化、细胞、动物多层次多水平综合判断建立香菇柄多糖抗氧化活性与结构和量之间的关系，进而为香菇柄多糖的相关研究提供指导，为高附加值香菇产品的获得提供支持。