烟草青枯病拮抗菌的分离筛选与抑菌活性物质研究

汤鸣强，林天然，李小芳，周晓勤，曾文龙，林晓路，彭水莲

（1.福建师范大学福清分校海洋与生化工程学院，福建 福清 350300；2.现代设施农业福建省高校工程研究中心，福建 福清350300；3.福建省烟草公司龙岩市公司，福建 龙岩 364000；4.龙岩市烟草公司长汀分公司，福建 长汀 366300）

烟草青枯病是一种土传性细菌病害，由青枯雷尔氏菌（Ralstoniasol anacearm）侵染而引起［1］。该病菌株系表现型与基因型多样化，对环境适应能力强，可感染250多种植物［2］。烟草青枯病普遍发生于中国长江流域及其以南地区，近年来福建、广东及云南等局部地区均发生过严重的病害，平均发病率高达30%～85%，使得烟草产量和品质下降［3］，在部分重病区经常导致全田发病、绝产无收。

国内外学者对烟草青枯病的防治开展了广泛的研究，涉及栽培管理、抗病品种选育、化学药剂防治和生物防治等方面。其中，化学药剂防治仍是控制烟草青枯病的主要技术手段［4，5］，但长期大量使用化学药剂容易导致病原菌抗性增加，并造成环境污染和农产品有害物质残留超标。生物防治具有经济、无公害、效果长久等优点，符合农业可持续发展的要求，其中拮抗放线菌及其代谢产物的分离筛选一直是植物病害生物防治的重要内容，对烟草生产和生态环境保护意义重大［6］。张薇［7］从土壤中筛选到一株放线菌Y23对烟草青枯病菌表现出较好的抑制效果，其抑菌圈直径达13.4 mm，菌株产生的抗菌物质对紫外光和热稳定性较好。陆铮铮等［8］采用平板对峙培养法，分离筛选到3株烟草青枯病菌拮抗放线菌，分别为玫瑰暗黄链霉菌、橄榄绿链霉菌和黄麻链霉菌。罗文建等［9］从健康烟田根际土壤中分离到对青枯雷尔氏菌具有明显拮抗作用的链霉菌LC-7，该菌株对烟草青枯病具有显著的防治效果，防效为85.48%。

本研究从福建省龙岩市上杭县烟区健康烟株根际土壤分离到多株青枯病拮抗放线菌，其中，菌株FQ-7的拮抗活性最强，通过形态培养特征观察、生理生化试验及16S rDNA序列测定，确定菌株FQ-7的分类地位。菌株FQ-7发酵液提取物经萃取浓缩，研究其在不同温度、不同pH及不同紫外光照射时间下的稳定性，为该菌株应用于烟草青枯病的生物防治提供新的资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 土壤样品 采自福建省龙岩市上杭县下枋村烟区健康烟草周围的土壤，采集时间为2019年5月。对土壤样品进行适当的处理后，将其用无菌样品袋密封，做好标记，放入冰箱4℃保存备用。

1.1.2 供试病原菌与烟草品种 烟草青枯病菌XQ23菌株分离自福建省龙岩市上杭县庐丰畲族乡烟田土壤，分离菌株置于25%甘油中，-80℃保存。供试烟草品种为云烟87，由福建省烟草公司龙岩市分公司提供。

1.1.3 培养基 种子培养基每升含可溶性淀粉20.0 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g。发酵培养基每升含大豆粉30.0 g，可溶性淀粉20.0 g，CaCO32.0 g，NaCl 2.0 g。营养肉汤（NA）培养基每升含牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 7.0～7.2。菌株形态培养观察以及生理生化试验所用培养基参照文献配制［10-12］。

1.2 拮抗菌的分离与筛选

1.2.1 拮抗菌分离 按照稀释分离法制备土壤悬液并进行稀释，制成不同稀释度的土壤悬液。吸取不同稀释度的土壤悬液于高氏一号培养基平板上，均匀涂布，置于28℃恒温培养4 d。选择干燥、不透明、表面呈紧密丝绒状的单菌落划线接种于高氏一号培养基平板上，分离纯化3～5次，得到9株放线菌菌株，依次编号为FQ-1至FQ-9，纯化后置于-20℃冰箱保存。

1.2.2 拮抗菌的筛选 以烟草青枯病菌XQ23菌株为靶标菌，采用双层琼脂法筛选拮抗菌。供试菌株经活化后接种于高氏一号培养基平板上，28℃恒温培养5 d，取菌块置于平板中央。每菌株3次重复，28℃定殖培养4 d。取15 mL经活化的含有烟草青枯病菌XQ23的NA培养基，覆盖于上述平板。以不加拮抗菌菌块为对照，置于28℃恒温培养1 d后观察抑菌情况。将初筛得到的拮抗菌接种于20 mL种子培养基中，28℃、180 r/min培养24 h作为种子液。取3 mL种子液移入基础发酵培养基中培养6 d（28℃、200 r/min），离心10 min（4℃、8 000 r/min），上清液经0.22μm滤膜过滤除菌后备用。用琼脂扩散法测定其抑菌活性，即将烟草青枯病菌制成菌悬液加入到NA培养基中，混合均匀，倒成平板，凝固后用无菌打孔器在含菌平板中打孔，每孔中加入拮抗菌发酵液100μL，28℃恒温培养24 h后测量抑菌圈直径，每个处理重复5次。

1.3 拮抗菌的鉴定

观察描述菌株FQ-7在光学显微镜和扫描电镜下的形态特征。参照文献［11，13］，进行菌株FQ-7培养特性和生理生化试验。菌株FQ-7 16S rDNA序列测定参照叶海霞等［14］的方法。PCR扩增产物经电泳检测后，送科标技术（青岛）研发中心进行双向测序。测序结果经在线分析，同GenBank中的有关序列进行同源性比对并构建系统进化树。

1.4 拮抗菌FQ-7抗菌活性物质分离及其特性

1.4.1 抗菌活性物质的分离 拮抗菌FQ-7在种子培养基活化培养24 h后移入液体基础发酵培养基中培养6 d（200 r/min），发酵液经离心取上清液（4℃，8 000 r/min），上清液与乙酸乙酯按照1∶1比例振荡混合1 h后静置萃取，将所得萃取液合并浓缩至5倍浓度，经0.22μm滤膜过滤后即为粗提液。

1.4.2 拮抗菌FQ-7抗菌活性物质的检测 参照“1.2.2”描述的琼脂扩散法检测不同处理下拮抗菌FQ-7抗菌活性物质的抑菌效果。每个处理重复5次，28℃恒温培养24 h，用无菌水作阴性对照，30 μg/mL庆大霉素作阳性对照。

1.4.3 拮抗菌FQ-7抗菌活性物质的稳定性分析大量制备拮抗菌FQ-7发酵液，按照“1.4.1”的方法，获得抑菌活性物质乙酸乙酯萃取物，经适当浓缩后将 其 置 于 不 同 温 度（40、60、80、100、110、115、121℃）、不同pH缓冲体系（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）和不同紫外灯照射时间（30、60、120 min），功率8 W，灯距20 cm处理，采用琼脂扩散法检测拮抗菌FQ-7抗菌活性物质的抑菌效果，以30μg/mL硫酸庆大霉素为对照，考察其对热、pH和紫外光处理的稳定性。相对抑菌活性=（处理组抑制菌直径/对照组抑菌圈直径）×100%。

1.5 数据处理与分析

采用Origin 9.1作图，数据统计分析利用SPSS 17.0软件完成，利用LSD多重比较法检测处理间差异显著性，显著性水平设定为P＜0.05。数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌的分离

采用稀释涂布法从健康烟株根际土壤中分离得到9株放线菌，用双层琼脂法进行初筛。试验结果表明，菌株FQ-7对烟草青枯病菌有明显的抑制效果，抑菌圈直径可达16.3 mm（图1A）。

2.2 拮抗菌FQ-7形态特征

将拮抗菌FQ-7接种于高氏一号固体平板上，28℃培养7 d。菌落形态特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状，上面有一层浅蓝色的粉状孢子。菌落与培养基连接紧密，难以挑取。该菌分泌水溶性色素，菌落表面呈淡蓝色，色素渗透入培养基，变成深蓝色（图1B）。光学显微镜下，该菌基内菌丝透明且较细，气生菌丝颜色较暗，直径较粗，呈淡青色。孢子丝波曲形，孢子丝成熟后形成的孢子链呈串珠状，表面光滑（图1C）。扫描电镜下可见拮抗菌FQ-7产短棒状分生孢子，表面光滑，分生孢子大小为（0.9～1.1）μm×（0.6～0.8）μm（长×宽）（图1D）。

图1 拮抗菌FQ-7的拮抗效果与形态特征

2.3 拮抗菌FQ-7培养特征

2.3.1 培养特征 拮抗菌FQ-7在供试的5种培养基上都能生长，其中，在燕麦粉琼脂培养基和高氏一号培养基上生长最好，其次是酵母精麦芽糖精琼脂和无机盐淀粉琼脂培养基。该菌在马铃薯浸汁培养基上生长最差，在5种供试培养基上形成不同特点的气生菌丝和基内菌丝，其可溶性色素的颜色也略有差异（表1）。

表1 拮抗菌FQ-7在不同培养基上的培养特征

2.3.2 菌株FQ-7的生理生化特性 该菌为兼性好氧型，接触酶、甲基红试验阴性，能分解淀粉与酪素，不耐盐，在10 g/L时生长速度最快。该菌能利用葡萄糖、甘露醇、蔗糖和麦芽糖，不能利用乳糖、纤维二糖、山梨醇和甜醇。

2.4 拮抗菌FQ-7 16S rDNA分析

16S rDNA序列测序结果表明，FQ-7的16S rDNA序列长度为1 484 bp。将该序列在GenBank中进行Blast检索，发现菌株FQ-7与链霉菌属（Strept omyces）菌株相似性最高，说明该菌株可能是链霉菌属的成员。系统发育树结果（图2）显示，FQ-7与菌株Streptomyces violaceolatus（KT363060）聚在同一分支上，同源性在99%以上。结合菌株FQ-7的形态培养特征、生理生化试验鉴定和16S rDNA序列系统发育分析，菌株FQ-7鉴定为紫边链霉菌（Streptomyces violaceolatus），命名为Streptomyces violaceolatusFQ-7。

图2 菌株FQ-7基于16S rDNA序列构建的系统发育树

2.5 发酵液活性物质研究

2.5.1 热稳定性 由图3可知，菌株FQ-7发酵液乙酸乙酯提取物经100～121℃热处理后，其抗菌活性均无显著性差异。在40～121℃，随着处理温度的升高，抑菌圈直径为7.8～8.3 mm，相对抑菌活性保持在88.51%～95.40%，说明FQ-7菌株产生的抗菌物质热稳定性较好。

图3 温度对菌株FQ-7抑菌活性的影响

2.5.2 酸碱稳定性 由图4可知，菌株FQ-7发酵液乙酸乙酯提取物抑菌活性在酸性和中性条件下比较稳定，且随着pH的升高，其抑制菌活性有逐渐下降的变化趋势。在试验pH范围内（pH 2.0～8.0），其抑菌圈直径为7.5～8.7 mm，相对抑菌活性保持在86.52%～99.88%，说明FQ-7菌株产生的抑菌物质具有较好的酸碱稳定性。

图4 pH对菌株FQ-7抑菌活性的影响

2.5.3 紫外光稳定性 由图5可知，随着紫外光照射时间的延长，菌株FQ-7发酵液乙酸乙酯提取物抑菌活性呈逐渐减弱的变化趋势。照射30～120 min，其抑菌圈直径为7.4～7.9 mm，相对抑菌活性保持在85.52%～91.05%，说明该菌株所产生的抑菌物质对紫外光照射的稳定性较好。

图5 紫外光对菌株FQ-7抑菌活性的影响

3 小结与讨论

植物根系周围分布有种类多样的微生物，根际环境是植物微生物互作的区域，其中，根际放线菌可诱导植物抗病性，激发耐旱能力或作为生防制剂［15］。有文献报道，这些放线菌可以通过产生抗菌物质、降解酶或挥发性物质等途径抑制植物病原菌的生长［16］。人类已发现的抗生素多数来源于放线菌，特别是链霉菌属放线菌［13］。当前，放线菌次级代谢产物研究的一个重要方向就是从中发现一些有应用潜力的农用抗生素及其产生菌，用于植物病害的防治［17］。罗文建等［9］从链霉菌LC-7中分离到一种新的氨基糖苷类抗生素，对烟草青枯病有显著的防治效果。Prabavathy等［18］研究Stre ptomycessp PM5对稻瘟病菌和水稻纹枯病菌的防控作用，发现该菌产生的2种脂肪族化合物有明显效果。李庆蒙［19］研究指出，Stre ptomycesPM5对烟草黑胫病菌、水稻稻瘟病菌和根霉等多种作物病原真菌具有生物活性，其抗菌物质对热处理、光照射及酸碱处理的稳定性较好。

本研究对生防菌Streptomyces violaceolatusFQ-7进行了形态培养特征观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列聚类分析，最终鉴定为紫边链霉菌。紫边链霉菌是土壤中常见类群［20，21］，但在生态系统中的功能了解较少。杜静［22］应用三重抗生素抗性筛选方法，从四川、湖北、山东、辽宁和黑龙江5省的土样中分离得到4株链霉菌，其发酵粗提物对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌及9种植物病原真菌表现出不同程度的抑制活性。其中，49号菌株同Streptomyces violaceolatus的相似性为99%，其发酵液上清液和菌体浸提液对甜椒菌核病菌、水稻纹枯病菌和黄瓜黑星病菌3种病原真菌的菌丝生长抑制率均在90%以上，但其发酵粗提物对温度的稳定性较弱，当温度达30℃时，其抑菌活性完全丧失。Hayakawa等［23］发现Streptomyces violaceolatusA32产生的3种异硫脲抗生素对革兰氏阳性菌有显著的抑菌效果，但对革兰氏阴性菌及真菌没有生物活性。还有研究发现分类上与Streptomyces violaceolatus相近的菌株Streptomyces violaceolatusA3产生放线菌紫红素（Actinorhodin）、次甲霉素（Methylenomycin）、十一烷基灵菌红素（Undecylprodigiosin）和钙依赖型抗生素［24］。Streptomyces violaceolatusFQ-7对营养和环境条件要求较低，分离简便，抑菌活性物质对热、pH和紫外光照射稳定性强，表明该菌在生防方面潜在的应用价值，为青枯病菌的生物防治提供了新的微生物资源。