台湾相思甲醇提取物抑菌活性研究

庞皓元

（广西壮族自治区食品药品检验所，南宁 530021）

有害微生物对农业生产和人类健康造成严重危害，植物病原真菌引起的真菌病害是植物病害中最大的一类，每年给农作物造成重大损失。长期以来，采用化学农药如多菌灵、甲基托布津等来控制真菌病害，但化学农药在农产品中的残留容易损害人类健康。细菌感染同样也是人类常见的病因之一。抗菌素和磺胺类药物出现后，细菌感染得到有效控制，直至今日仍被广泛应用，但抗菌素及磺胺类药的滥用带来了诸多问题，如毒性反应、二重感染、细菌耐药性以及药物有害残留等。从植物中寻找抗菌活性物质，进一步开发为植物源杀菌剂及抗菌新药是解决上述问题的一条重要途径［1，2］。

台湾相思（AcaciaconfusaMerr.）为含羞草科（Mimosaceae）金合欢属植物，别名相思树、台湾柳、相思仔，为常绿乔木，高6～15 m，苗期第一片真叶为羽状复叶，长大后小叶退化，叶柄变为叶状柄，长6～10 cm，宽5～13 mm，主要分布于中国台湾、福建、云南及两广等地，印度尼西亚、斐济、菲律宾也有分布［3］。台湾相思生长迅速，耐干旱，是华南地区荒山造林、水土保持和沿海防护林的重要树种［3］。其木材材质坚硬，可用来做家具、车轮、桨橹等，因此，目前对台湾相思的研究多集中在植树造林及材质的研究上，也有文献报道其酚类物质具有较好的抗氧化活性及抗肝炎病毒活性［4-8］，而其抑菌活性鲜见报道。本研究旨在明确台湾相思甲醇提取物的抑菌活性，为其进一步研究和开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料及试剂 台湾相思叶状柄（广西北海市采集）；甲醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、氯化钠、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、马铃薯、NaOH（专用调pH）、消毒乙醇、去离子水等。

1.1.2 仪器 恒温鼓风干燥箱、植物粉碎机、超声波清洗器、真空抽滤泵、高压蒸汽灭菌锅、旋转蒸发仪、超净工作台、电子天平、移液枪、移液管、打孔器、接种环、涂棒、恒温培养箱等。

1.1.3 供试病原菌 如表1所示，共11种植物病原真菌，其中，9种由广西大学提供，金桔砂皮病菌和柑橘链格孢菌由广西桂林市柑橘研究所提供，并用PDA培养基进行扩菌培养后于冰箱中4℃保存备用；14种动物病原菌由桂林医学院微生物实验室提供，并用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基进行扩菌培养后于冰箱中4℃保存备用。

表1 供试病原菌种类

1.2 方法

1.2.1 植物成分的提取 植物材料用恒温鼓风干燥箱60℃烘干至发脆，用植物粉碎机粉碎。干粉按1∶5的比例加入甲醇，超声辅助提取30 min（频率45 kHz，100 W）［9，10］，抽滤，滤液50℃减压浓缩，得到膏状提取物。置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 培养基的制备

1）PDA培养基的制备。PDA培养基用于真菌的培养，配方为马铃薯200 g，琼脂17～20 g，蔗糖20 g，去离子水1 000 mL。将去皮马铃薯切成小块，加入1 000 mL去离子水加热煮沸30 min后用4层纱布过滤，补充去离子水至1 000 mL，再煮，加琼脂15～17 g，再加蔗糖20 g，煮沸即可，将配制好的培养基置于121℃高压蒸汽灭菌30 min，取出，晾凉，置冰箱中保存备用。

2）牛肉膏蛋白胨培养基的制备。牛肉膏蛋白胨培养基用于细菌的培养，配方为蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂17～20 g，去离子水1 000 mL，pH 7.0～7.2。准确称取各成分，将除琼脂粉外的成分先倒入沸水中，最后加入琼脂粉，用玻璃棒搅拌溶液混均后停止加热，用NaOH调至所需pH。将配制好的培养基置于121℃高压蒸汽灭菌30 min，取出，晾凉，置冰箱中保存备用。

1.2.3 对植物病原真菌的抑菌活性测定 将台湾相思甲醇提取物干膏用丙酮和去离子水按1∶1超声溶解，配制成100 g/L溶液，在超净工作台无菌条件下，用移液枪吸取1 mL药液与9 mL热的PDA培养基在直径9 cm培养皿中混合均匀制成10 g/L的带毒培养基。待培养基凝固后，用直径4 mm的打孔器在培养好的供试真菌菌落边缘切取菌饼，用接种针将菌饼接在带毒培养基表面，使带菌丝的一面朝下，每皿接3个菌饼［11］。设置对照组（CK，丙酮与去离子水1∶1混合）。置于27℃恒温培养箱中培养，分别于24、48、72 h观察菌丝生长情况。

经过如上试菌试验，初步了解粗提物在10 g/L的浓度时对辣椒炭疽病菌、茶轮斑病菌、甘蓝黑斑病菌、甘蔗凤梨病菌、金桔砂皮病菌、玉米小斑病菌、玉米大斑病菌、柑橘链格孢菌有一定的抑菌效果，对花生冠腐病菌、烟草黑胫病菌的抑菌效果不明显，对水稻胡麻叶斑病菌具有促进生长作用。将带毒培养基浓度降低为10.0、5.0、1.0、0.5、0.1 g/L进行试验，采用生长速率法测定台湾相思的抑菌活性；对花生冠腐病菌、烟草黑胫病菌和水稻胡麻叶斑病菌将浓度提高到20.0 g/L。在菌落长到最大时（再继续长菌落就会重合），用十字交叉法测量菌落直径，并按此式计算抑菌率：抑菌率=［（对照菌落直径-菌饼直径）-（处理菌落直径-菌饼直径）］/（对照菌落直径-菌饼直径）×100%。

1.2.4 对动物病原菌的抑菌活性测定 用丙酮和去离子水按1∶1混合超声溶解台湾相思甲醇提取物干膏，配制成100 g/L溶液，在超净工作台无菌条件下，用移液枪吸取1 mL药液与9 mL热的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在直径9 cm的培养皿中混合均匀制成10 g/L的带毒培养基。待培养基凝固后，用移液枪吸取稀释后的菌悬液0.1 mL，滴到培养基表面，用涂布棒涂布均匀。设置对照组。置于37℃恒温培养箱中培养，分别于24、48 h观察菌落生长情况。

经过观察，初步了解到提取物在10 g/L浓度时对伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、蜡样芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌有明显抑制作用，对产气肠杆菌、乙型副伤寒杆菌、炭疽杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌则无明显抑菌效果。采用液体培养基稀释法测定对细菌的抑菌活性［11］，将0.05 mL菌悬液与0.95 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基混合制成带菌培养基，将药液配制成100、50、10、5、1 g/L，再用移液枪吸取0.1 mL与0.9 mL带菌培养基混合，这样药液的浓度稀释了10倍。分别于24、48 h后观察液体培养基的澄清浑浊情况，并记录，再缩小浓度范围重复试验。对产气肠杆菌、乙型副伤寒杆菌、炭疽杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌采用滤纸片法［11］，用打孔器将滤纸打成6 mm的圆片，灭菌，置于100 g/L的药液中浸泡几分钟，夹出自然晾干，贴到已涂布细菌的培养基上，每个培养皿放4片滤纸，在中间放置对照（CK）滤纸，24、48 h后观察有无抑菌圈，并用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.5 提取物的初步分离 用液-液萃取法对台湾相思提取物进行初步分离。提取物用去离子水超声波辅助溶解。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按1∶1萃取，最后进行旋转蒸发，石油醚层和乙酸乙酯层用40℃水浴减压蒸发浓缩，正丁醇层和水层用80℃水浴减压蒸发浓缩。将所得每层蒸膏分别进行病菌抑菌效果测定。真菌用生长速率法测定，培养于5.0 g/L的带毒培养基上；细菌用10.0 g/L的滤纸片进行测定。真菌和细菌的药液浓度不同主要由药液对其的抑菌活性以及各萃取层溶解难易程度决定。

2 结果与分析

2.1 台湾相思提取物对植物病原真菌的抑菌活性

由试验结果（表2、表3）来看，在供试的11种病原真菌中，在低浓度药液下对玉米大斑病菌和玉米小斑病菌等几种菌有促进生长作用，而在台湾相思甲醇提取物浓度为10.0 g/L时，对8种菌有抑菌效果，其中，抑菌率达50%以上的有5种（包括金桔砂皮病菌）。将台湾相思甲醇提取物浓度提高到20.0 g/L时，对原来没抑制效果和有促进生长作用的烟草黑胫病菌、水稻胡麻叶斑病菌表现出了较强的抑制效果。而对于花生冠腐病菌，对其孢子有一定的抑制效果，但对于其菌丝的生长没有抑制作用。表明台湾相思甲醇提取物对真菌具有较广谱的抑菌活性，且对某些真菌，如甘蓝黑斑病菌在10.0 g/L（相当于0.042 g DW/mL）的浓度下有较强烈的抑制作用。蒋红云等［12］研究的96种植物甲醇提取物在0.05 g DW/mL时，对玉米大斑病菌抑制率在80%以上的植物有21种，对玉米小斑病菌抑制率在50%以上的植物有50种。而丘麒等［13］研究表明21种植物甲醇提取物在10 mg DW/mL时，对甘蔗凤梨病菌的抑菌率超过22.76%的有8种，而本研究中台湾相思在此抑菌率时的浓度为1.0 g/L（相当于4.2 mg DW/mL），可见台湾相思对真菌抑菌作用较强。

表2 台湾相思甲醇提取物不同浓度对几种真菌的抑制活性

表3 台湾相思甲醇提取物浓度为20.0 g/L对其10.0 g/L不能抑制的3种真菌的抑制效果

2.2 台湾相思提取物对动物病原细菌的抑菌活性

由表4、表5可知，在台湾相思甲醇提取物浓度为10.0 g/L的条件下，24、48 h内，台湾相思对9种病原细菌有抑制活性，其中，对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、痢疾志贺氏菌的抑制效果最强，在1.0 g/L浓度下就达到抑制效果，而对伤寒沙门氏菌则要10.0 g/L的浓度才能抑制。将浓度增加到100 g/L，对原10 g/L浓度时没有抑制效果的绿脓杆菌、大肠杆菌、乙型副伤寒杆菌也产生了抑菌效果，但对产气肠杆菌和炭疽杆菌仍然没有抑制效果。表明台湾相思对病原细菌同样具有较强的抑制活性。

表4 台湾相思甲醇提取物不同浓度对几种细菌的抑制活性

2.3 提取物各萃取层对病原真菌的抑菌活性

由表6可以看出，对8种病原真菌的有效成分主要集中在正丁醇层，在5 g/L的浓度下，除柑橘链格孢菌之外，抑菌效果均在80%以上。此外，乙酸乙酯层对甘蔗凤梨病菌也有较强的抑菌活性，对玉米大斑病菌的抑菌率也超过了50%；水层对玉米大斑病菌和甘蓝黑斑病菌有较好的抑菌效果。在粗提物抑菌试验中低浓度促进玉米小斑病菌菌丝生长的可能原因是石油醚层和乙酸乙酯层中低极性有机物有利于其生长；而促进玉米大斑病菌生长可能是有效成分结合在一起，降低了活性，反而利于真菌的生长。

表6 台湾相思提取物不同萃取层5 g/L浓度时对几种真菌的抑制效果

2.4 提取物各萃取层对病原细菌的抑菌活性

由表7可以看出，对细菌的有效成分主要分布在乙酸乙酯层，但不是对所有的细菌都一样。对溶壁微球菌和巨大芽孢杆菌的有效成分在正丁醇层和水层。但总的来说虽然对每种菌都产生了抑菌圈，但大部分细菌能在抑菌圈内生长少量细菌，说明抑菌不完全，但对在低浓度的粗提物就有很好抑制效果的蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和痢疾志贺氏菌在乙酸乙酯层的药液有较大的抑菌圈且抑菌圈内不生长细菌，说明台湾相思对这些细菌的抑制效果好。

表7 台湾相思提取物不同萃取层10 g/L浓度时对细菌的抑制效果

3 小结与讨论

本研究摘取台湾相思的叶状叶柄晒干打粉，用甲醇超声波辅助提取30 min，50℃水浴旋转减压蒸发浓缩得到蒸膏，干膏率为23.8%。研究蒸膏配制药液对病原菌的活性。结果表明，台湾相思甲醇提取物对病原真菌和细菌均具有广谱的抑菌活性，且活性较高。在台湾相思提取物10.0 g/L浓度下对11种供试真菌中的8种有活性，其中，5种的抑菌率达50%以上，5种中有3种达90%以上。同样，在10.0 g/L浓度下对14种供试细菌中，对9种有活性，其中3种细菌在1.0 g/L浓度下就有很好的抑菌效果，远高于其他植物提取物的抑菌效果。在液-液萃取分离试验中，各萃取层萃取的物质所占的比例分别为石油醚层18%、乙酸乙酯层17%、正丁醇层32%、水层27%。对病原真菌的抑制活性物质主要存在于正丁醇层，在5 g/L浓度下对7种真菌的抑菌率在80%以上；而对病原细菌的抑制活性物质主要存在于乙酸乙酯层，但对于个别细菌，活性物质存在于正丁醇层和水层。

从植物中寻找杀菌抑菌活性物质是开发无公害新型杀菌剂的有效途径之一。物竞天择，适者生存是自然界的法则，生物在进化的过程中有相互促进也有相互抑制，在自然界暴发的病害也可以在自然界中找到抑制其的物质。中草药是前人在自然中对抗疾病所积累的经验植物，目前寻找杀菌抑菌活性物质的研究也多集中在中草药。但在新的时代，细菌不断变异进化，必须不断开发新的植物以填补中草药的空缺。台湾相思分布在中国东南部，作为景观树和防护林种植，有一定的资源量。本研究初步研究了其抑菌活性，还有待更深入地研究其活性物质，以丰富植物源药的种类。