气相色谱-质谱法检测药物中3种苯磺酸酯类基因毒性杂质

2021-10-23董海峰杨俊免张煜玲

分析仪器 2021年3期

董海峰汤桦杨俊免张煜玲李彪*

(1.石家庄四药有限公司药物研究院，河北省大容量注射剂工程技术研究中心，注射给药系统工程技术研究中心，石家庄 050000；2.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所，北京100013)

基因毒性杂质是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其他类型的无致突变性杂质[1]。其研究起源于欧洲发生的维拉赛特(甲磺酸奈非那韦)事件，欧洲药政管理部门要求所有相关的上市许可持有人对在他们的药品中是否会出现这些杂质开展风险评估。欧洲药品评估局，人用药品委员会(CHMP)推出《遗传毒性杂质限度指导原则》[2]，引入了可接受风险的摄入量，即毒理学关注阈值(TTC)这个概念。根据此阈值，按照每日预期的摄入量去计算出该活性药物中能够接受的杂质水平。苯磺酸左旋氨氯地平为二氢吡啶类长效钙离子拮抗剂，具有钙通道阻滞剂的特性。其对于治理高血压有效果显著，持久性好，副作用低等特点[3-5]，作为处方药广泛用于治疗高血压病和心绞痛病。由于苯磺酸左旋氨氯地平原料中含有的苯磺酸可能会与原料中残留的醇类发生反应生成苯磺酸酯类基因毒性杂质[6]，而根据ICH M7[7]指导原则，需要对苯磺酸左旋氨氯地平中潜在的苯磺酸甲酯(Methyl Benzenesulfonate, MBS)、苯磺酸乙酯(Ethyl Benzenesulfonate, EBS)、苯磺酸异丙酯(Isopropyl Benzenesulfonate, IBS) 进行研究控制。目前苯磺酸酯类物质的检测方法报道较少，已报道的检测方法有HPLC-UV法[8-10]，LC/MS法[11]，SPME-GC/MS法[12]等。但以上方法存在基质干扰，适用范围受限，灵敏度不佳等不足之处。本实验以苯磺酸左旋氨氯地平片为例，建立药物中苯磺酸酯类物质衍生HS-GC/MS的检测方法。该方法使用碘化钠对苯磺酸酯类物质进行衍生生成碘代烷，衍生法与直接进样法相比较，灵敏度有较大的提高，检测限值远低于限度要求，可灵敏准确的检测苯磺酸酯化合物；与萃取法相比，顶空法具有选择性强，基质干扰小等特点。该方法可以满足药物(苯磺酸左旋氨氯地平片)中3种苯磺酸酯类物质的检测监控工作。

1 仪器与试药

7890B-7000D气相色谱-质谱联用仪(安捷伦公司)；TurboMatrix 40全自动顶空仪(珀金埃尔默公司)；XS-205电子天平(d=0.01 mg/0.1 mg，梅特勒公司)；Milli-Q纯水机(Merck millipore公司)。

苯磺酸甲酯(纯度>98.0 %)采购于TCI公司；苯磺酸乙酯(纯度>98.0 %)采购于TCI公司；苯磺酸异丙酯(纯度>97.0 %)采购于阿拉丁公司；甲磺酸丁酯(纯度98.5 %)采购于百灵威公司；碘化钠(纯度 99.0 %)采购于百灵威公司；无水硫代硫酸钠(纯度99.0 %)采购于阿法埃莎公司；乙腈(色谱级)采购于默克公司；甲苯(色谱级)采购于默克公司。

2 方法

2.1 溶液制备

稀释剂：将适量的水和乙腈按照20∶80(体积比)配制成混合溶液。现配现用。

衍生试剂：称取60 g碘化钠和30 mg无水硫代硫酸钠，置于同一50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度线，摇匀，即得。现配现用。

内标溶液：量取10μL甲磺酸丁酯，置于10 mL容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度线，摇匀；另精密量取此液0.4 mL于2000 mL稀释剂中，摇匀，即得。现配现用。

对照品母液：精密称取苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸异丙酯对照品约10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲苯溶液溶解，并稀释至刻度线，摇匀，即得。现配现用。

混合对照品贮备液：精密量取各对照品母液0.5 mL，置于100 mL容量瓶，用内标溶液稀释至刻度线，摇匀，即得。现配现用。

混合对照品溶液：精确量取混合对照品贮备液0.5 mL，置于10 mL容量瓶，加内标溶液稀释至刻度，摇匀，即得。现配现用。

定量限溶液：量取对照品母液适量分别置于100 mL容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀；另取上述各溶液适量置于100 mL容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，摇匀，配制得到每毫升溶液中含苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯分别为3.57 ng、4.61 ng、6.13 ng。现配现用。

线性对照品溶液：分别量取混合对照品贮备液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL和1.2 mL分别置于10 mL容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度线，摇匀，即得。现配现用。

准确性样品制备：称取25 mg供试品于20 mL顶空瓶中，分别添加3个浓度水平(1.00、4.00、6.00 mg·kg-1)的混合对照品溶液各3份，加0.5 mL内标溶液，0.5 mL衍生溶液，立即加盖密封，立即检测。现配现用。

对照品溶液制备：准确移取混合对照品溶液0.5 mL，置于20 mL顶空瓶中加入0.5 mL衍生溶液，立即加盖密封，立即检测。

供试品制备：取供试品于研钵中研磨，称取粉末约25.00 mg，精密称定，置于20 mL顶空瓶中，加0.5 mL内标溶液，0.5 mL衍生溶液，立即加盖密封，立即检测。供试品为苯磺酸左旋氨氯地平片，由石家庄四药有限公司提供。

2.2 分析条件

顶空条件：加热炉温度：60 ℃；平衡时间：30 min；取样针温度：80 ℃；传输线温度：120 ℃；进样时间：0.02 min。

气相色谱条件：色谱柱：VF-WAXms毛细管柱 (30 m×0.25 mm×1.0 μm)；载气：He(纯度99.999 %)；柱流速：0.8 mL·min-1；进样口温度：220 ℃；进样方式：分流进样(20∶1)；柱箱温度：初始40 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1升至140 ℃，保持0 min；后运行：230 ℃，保持8 min。

质谱条件：传输线温度：220 ℃；四级杆温度：150 ℃；离子源温度：230 ℃；离子检测方式：选择离子扫描(SIM)模式；苯磺酸甲酯(BSM)、苯磺酸乙酯(BSE)、苯磺酸异丙酯(IMS)、甲磺酸正丁酯(BMS)，经衍生后依次得到碘甲烷(Mel)、碘乙烷(Etl)、碘异丙烷(iPrl)、碘正丁烷(Bul)。4种分析化合物(BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl、BMS-Bul)的质谱参数见表1。

表1 4种分析化合物质谱参数

3 结果与讨论

3.1 色谱条件的优化

分别考察了色谱柱(DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、DB-624(30 m×0.25 mm×1.4 μm)、VF-WAXms(30 m×0.25 mm×1.0 μm)、柱流速(0.5、0.8、1.0 mL·min-1)、进样时间(0.01、0.02、0.03 min)对实验结果的影响，考察了4种分析化合物(BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl、BMS-Bul)的分离效果及响应情况，确定最优的色谱条件。图1为空白溶液、苯磺酸左旋氨氯地平及混合对照品溶液的色谱图。色谱柱对比发现， DB-5MS、 DB-624色谱柱的固定相极性较弱，对4种分析化合物保留性较差，VF-WAXms属于极性气相色谱柱对4种分析化合物具有较好的保留性和分离度。4种分析化合物随着柱流速的增加，响应呈现上升趋势，而随着进样时间的增加，在0.02min后呈现稳定趋势。综合考虑，最优的柱流速和进样时间分别为0.8 mL·min-1和0.02 min。在最优的检测条件下，苯磺酸左旋氨氯地平对4种分析化合物检测无干扰且响应较好。图1为空白溶液、苯磺酸左旋氨氯地平及混合对照品溶液的色谱图。

图1 优化的HS-GC/MS条件下样品溶液色谱图

3.2 方法学考察

3.2.1 灵敏度、定量范围及线性方程

采用3倍信噪比对应浓度为检出限，10倍信噪比为定量限。苯磺酸甲酯、苯磺酸乙酯、苯磺酸异丙酯的检出限(LODs)及定量限(LOQs)见表2。配制6份定量溶液，并连续进行检测，结果见表3。结果显示，各成分检测限、定量限均能满足检测要求(限量要求：150 ng·mL-1)，并且该方法在定量限浓度具有较好的重复性。

表2 3种苯磺酸酯化合物的检测限和定量限

表3 3种苯磺酸酯化合物定量限的重复性(n=6)

取线性对照品溶液和定量限溶液经HS-GC/MS分析检测，以对照品浓度(ng·mL-1)为横坐标，相对响应值为纵坐标，绘制标准曲线。3种苯磺酸酯化合物的标准曲线及相关系数见表4。结果显示，3种苯磺酸酯化合物线性关系良好，适合定量分析。

表4 3种苯磺酸酯化合物的标准曲线及相关系数

3.2.2 精密度和重复性

配制6份对照品溶液，连续检测。计算各组分相对响应值的相对标准偏差(RSD)，考察日内精密度(编号1-6)。选取与日内精密度不同的检测日期对混合对照品溶液重复以上检测过程，计算各组分两次检测相对响应值的RSD，考察日间精密度(编号：1-12)。结果见图2，误差线为标准差(n=6,12)。结果显示，3种苯磺酸酯化合物日内精密度(n=6)的RSD在1.06%～1.82%之间；日间精密度(n=12)的RSD在0.83%～2.73%之间。该方法精密度良好。

图2 3种苯磺酸酯化合物的日内精密度(n=6)和日间精密度(n=12)

配制6份供试品样品，经HS-GC/MS分析检测，计算各组分相对响应值的RSD，考察重复性。结果显示，6份供试品样品中均未检出BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl。本方法检测重复性良好。

3.2.3 准确性

在苯磺酸左旋氨氯地平片中分别添加3个浓度水平(1.00、4.00、6.00 mg·kg-1)的混合对照品溶液各3份。计算3种苯磺酸酯化合物的加样回收率，考察方法准确度。结果见图3，误差线为标准差(n=3)。9份样品BSM-Mel、BSE-Etl、IMS-iPrl的平均回收率(RSD)分别为109.89%(1.83%)、106.13%(3.87%)、103.32%(1.62%)。结果显示，该方法准确度良好。

图3 3种苯磺酸酯化合物的准确度(n=9)

3.2.4 耐用性

通过微调色谱条件，考察各组分相对响应值的变化。调整色谱条件：升温速率12 ℃·min-1和8 ℃·min-1，柱流量0.85 mL·min-1和0.75 mL·min-1，起始温度42 ℃和38 ℃，加热炉温62 ℃和58 ℃，保温时间32 min和28 min。结果见图4，误差线为标准差(n=11)。共计11种不同检测条件下，3种苯磺酸酯化合物的RSD在3.96%～6.59%之间。结果显示，各组分之间分离效果良好，且对定量检测无影响，该方法耐用性良好。