超声波预处理结合控温控湿发酵对黑蒜色变及风味品质的影响

王浩宇,刘肖,2,赵珠莲,周才琼,3*

1(西南大学 食品科学学院,重庆,400715) 2(川北幼儿师范高等专科学校,四川 广元,628017) 3(重庆市特色食品工程技术研究中心,重庆,400715)

大蒜(AlliumsativumL.)是一种广泛使用的药食两用物质,既是“天然抗生素”,又是重要的调味料。但大蒜较强的辛辣味和刺激性影响其接受度,加上水分含量高,不耐贮藏,属半易腐物质[1],因此,大蒜及深加工备受关注。常见的大蒜加工产品有糖蒜、腊八蒜、蒜泥、蒜片和蒜粉等[2-3],近年受关注的有作为保健食品开发的大蒜素以及发酵加工产品如黑蒜[4-5]。

黑蒜是兴起于21世纪初的一种以大蒜为原料、经控温控湿发酵加工黑变并可直接食用的健康食品[6]。由于发酵期间各滋味成分含量及组成发生改变,获得了较为适当的酸甜味感,挥发性风味物质中刺激味含硫化合物如二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚含量减少[7],噻吩、呋喃等香气化合物增加[8],整体口感黏弹软糯似果脯,在日本、韩国、泰国较为流行[9]。近年来,进入我国市场。传统黑蒜主要采用高温高湿发酵[10],制作周期长达3个月,能耗较高。有少量通过改进工艺技术来缩短黑蒜发酵时间的研究报道,如采用三段式变温发酵法[11]、低温冷冻预处理结合变温发酵法[12]、微波预处理[13]、高压预处理[14],以及将蒜瓣破碎后采用液态发酵的方法[15]等,发酵时间缩短到15～30 d,但这些方法发酵时间仍然较长,有的工艺较为复杂,或采用粉碎发酵影响产品应用。采用预处理是缩短黑蒜发酵时间的重要手段,一定的预处理可使大蒜细胞组织结构破坏,促进美拉德反应,加快发酵黑变速度以缩短发酵工艺周期、降低能源消耗。

超声波作为一种新食品加工技术可通过空穴效应导致细胞结构破坏,释放细胞内活性物质,从而加速食品化学变化以形成特有风味[16],具有易操作,低成本和环境友好等优点[17],已被广泛用于食品领域[18]。本研究通过对大蒜采用超声波预处理后进行控温控湿发酵,探讨黑蒜发酵中色变及风味品质变化,以期进一步缩短黑蒜发酵时间和简化工艺。

1 材料与方法

1.1 材料

大蒜,巫山紫红天蒜股份合作联合社。

1.2 主要试剂

硼酸、CuSO4、K2SO4、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、甲基红、溴甲酚绿、亚甲基蓝、硫酸锌、亚铁氰化钾、茚三酮、没食子酸、焦性没食子酸,成都市科龙化工试剂厂;丙酮酸、2,4-二硝基苯肼、三氯乙酸、福林酚试剂、冰乙酸,重庆骏伟广生科技有限公司;5-羟甲基糠醛试剂、对甲基苯胺、巴比妥酸、亮氨酸、高锰酸钾、乙酸钠、乙二醇、亮氨酸、异丙醇、抗坏血酸,重庆川东化工试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.3 仪器与设备

GCMS-2010气相质谱联用仪、UV-2450紫外-可见分光光度计,日本岛津公司;KQ-500DE数控超声器,昆山超声仪器有限公司;TG16G离心机,常州峥嵘仪器有限公司;Ultra Scan PRO测色仪,美国HunterLab公司;SH010恒温恒湿试验箱,上海福絮实验室仪器设备厂。

1.4 实验方法

1.4.1 超声波预处理及黑蒜制备

超声波预处理:取新鲜蒜头500 g,以PVDC膜包裹后置超声器中,以预处理后蒜瓣色变为基础,通过预实验确定超声波频率40 kHz,超声功率300 W,40 ℃处理30 min,然后置于40 ℃,相对湿度80%条件下放置平衡48 h。

黑蒜发酵:设计发酵相对湿度(70%、80%、90%)和发酵温度(70、75、80 ℃)进行2项分组全因素发酵工艺实验,每3 d取样分析,直至蒜瓣完成黑变。

1.4.2 分析方法

(1)色值[19]:选择大小相近的去外皮蒜瓣经充分研磨后进行分析。以标准白板校准,测量时分别记录L*、a*和b*值为所测样品亮度、红度和黄度值,L(明度)轴,0代表黑,100代表白;a(红-绿)轴,正值为红,负值为绿,0为中性色;b(蓝-黄)轴,正值为黄,负值为蓝,0为中性色重复测定6次。总色差值以dE*表示,按公式(1)计算:

(1)

式中:dL*、da*和db*表示处理后蒜瓣色值;L*,a*,b*表示处理前蒜瓣色值。

(2)游离氨基酸总量:参考文献[20]并稍作修改。称取1.0 g样品加入5.0 mL体积分数10%乙酸溶液进行研磨匀浆,转移至100 mL容量瓶用蒸馏水定容,滤纸过滤后,取0.25 mL样品滤液,置于20 mL干燥的具塞试管中,加入1 mL无氨蒸馏水、3 mL水合茚三酮试剂和0.1 mL 1 g/L抗坏血酸溶液后混匀,于100 ℃水浴5 min,冷却,迅速加入5 mL体积分数95%乙醇,盖好塞子振荡试管,溶液呈蓝紫色时用体积分数60%乙醇稀释至20 mL,在波长570 nm处测定吸光值,再根据标准曲线(y=0.050 9x-0.048 9,R2=0.999 6)计算样品中游离氨基酸的总量。

(3)其他指标:水分含量按照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中直接干燥法;总酸按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》进行测定;可溶性糖按照NY/T 2742—2015《水果及制品可溶性糖的测定 3,5-二硝基水杨酸比色法》进行测定;5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)参考安东[11]的方法稍作修改;大蒜素参考朱君芳[21]方法稍作修改。

(4)挥发性成分:参照潘璨等[22]的方法并稍作修改。

①挥发性成分萃取:样品去皮破碎后,精确称取2 g置于20 mL顶空进样瓶,50 ℃下水浴平衡30 min后,推出SPME萃取头,50 ℃下水浴萃取30 min,开始进样分析。

②GC-MS条件:鲜蒜及预处理大蒜色谱条件:DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)石英毛细管色谱柱,进样口温度250 ℃;载气(He)流速1 mL/min,不分流;进样量2 mL。升温程序:初始50 ℃,维持1 min后以3 ℃/min 的升温速率使温度上升到75 ℃,维持1 min后以1 ℃/min的速率上升至110 ℃,维持3 min后,再以2 ℃/min的速率上升至150 ℃,维持2 min,最后以10 ℃/min的速率使温度上升至280 ℃,维持3 min。

黑蒜色谱条件:柱型、进样口设置温度、载气流速、进样量皆同上,起始柱温50 ℃,维持2 min后,以1 ℃/min的升温速率将温度升至75 ℃并维持1 min,然后以10 ℃/min升至90 ℃,维持1 min,再以3 ℃/min升至210 ℃,最后以10 ℃/min升至280 ℃,维持1 min。

质谱条件:电子轰击电离源,电子轰击能量,70 eV,离子源温度250 ℃,接口温度280 ℃,质量扫描范围50～500 amu。

③数据分析:

定性分析:通过NIST08和NIST08S质谱数据库检索各组分,结合保留指数和人工质谱解析及参考文献等方法共同确定。

定量分析:按照峰面积归一法计算各组分相对含量。

1.4.3 发酵黑蒜的模糊数学感官评价

参考文献[23]的方法，建立感官评价小组、评价术语(表1)、评判对象因素集、权重集、评语集、单因素评判模糊矩阵，对样品进行综合评价，得到各个黑蒜样品的综合得分。

1.5 数据处理

结果以平均值±标准差表示,采用Origin 2018作图,SPSS 20.0进行单因素方差分析、Pearson相关性分析和主成分分析。P<0.01表示极显著,P<0.05表示显著。

2 结果与分析

2.1 黑蒜发酵过程中感官品质的变化

2.1.1 黑蒜发酵过程中水分含量变化

如表2所示,在相对湿度为70%～80%下随发酵温度升高,大蒜含水量在前期快速下降(P<0.05),多数处理在9 d后保持稳定,含水量在(31.96±6.29)%;相对湿度为 90%条件下发酵,随处理温度升高含水量升高,高于鲜蒜(65.88%)。75和80 ℃处理随发酵时间延长含水量升高,相对湿度为 90%条件下发酵9～15 d时含水量在57.30%～81.44%波动。这可能与高温高湿下蒸汽更易进入蒜瓣有关,此时可观察到大蒜发软,部分软烂,表明相对湿度为 90%太高,不宜作为发酵湿度条件。后续发酵相关指标分析只考虑相对湿度为 70%～80%的处理。

表2 含水量在黑蒜发酵过程中的变化 单位：%

2.1.2 黑蒜发酵过程中色泽的变化

5-HMF是 Maillard 反应重要的中间产物,也是色素沉积的潜在条件[24],5-HMF是黑蒜的呈色物质之一[25]。5-HMF在发酵中的变化实验结果如图1所示,5-HMF随发酵时间延长逐渐升高,6 d后快速上升(P<0.05),在相同相对湿度条件下随处理温度升高而升高,表明在本发酵湿度范围升高发酵温度可加速大蒜黑变。有报道5-HMF含量随温度和时间变化的函数关系符合一级反应动力学方程[26],高温下5-HMF含量随温度的升高呈指数增长趋势,本实验结果与之相符。

a-相对湿度70%; b-相对湿度80%图1 5-HMF在黑蒜发酵过程中的变化Fig.1 Changes of 5-HMF in black garlic fermentation

色值在发酵中的变化实验结果见图2。在相同相对湿度条件下,随发酵温度升高色变增大,随发酵时间延长色值快速升高后保持稳定(P<0.05)。色值对应蒜瓣色泽见图3,相对湿度为70%,75 ℃发酵3 d时的色值56.93,此时蒜瓣呈棕褐色(图3-a),发酵到6 d时,蒜瓣呈棕黑色,此时色值66.84(图3-b);在相对湿度为70%,70 ℃发酵12 d时的色值71.73,此时蒜瓣呈黑色(图3-c),相对湿度为70%,80 ℃发酵9 d时的色值81.96(图3-d),发现色值>70可判断黑蒜发酵黑变完成。本实验中,发酵6 d时各处理的色值在49.03～72.91,呈棕褐到棕黑色;以色变>70完成黑变为限值(图2),相对湿度为70%时发酵9 d各处理温度均完成黑变,相对湿度为80%发酵15 d均完成黑变,即低相对湿度和较高的发酵温度更利于发酵黑变,与前述5-HMF变化不一致,表明发酵黑变可能还受其他因素如维生素C和酚类物质等氧化褐变的影响。

a-相对湿度70%; b-相对湿度80%图2 色值在黑蒜发酵过程中的变化Fig.2 Changes of color value during black garlic fermentation

a-相对湿度为70%,75 ℃发酵3 d;b-相对湿度为70%,75 ℃发酵6 d;c-相对湿度为70%,70 ℃发酵12 d;d-相对湿度为70%,80 ℃发酵9 d图3 黑蒜发酵中的色值变化及对应色泽Fig.3 Change of color value and corresponding color in black garlic fermentation

2.2 黑蒜发酵中滋味品质成分的变化

2.2.1 可溶性糖含量的变化

可溶性糖含量随发酵时间延长快速增加(P<0.05)后下降,峰值在发酵9 d左右,此时甜味感最强(图4)。这种变化的可能原因是大蒜含水量不断下降,其次是大蒜总糖在发酵过程中的降解,后期下降可能与美拉德反应的消耗有关。不同相对湿度均以75 ℃下发酵时可溶性糖保持较高水平,发酵9～12 d时含量波动在41.02%～44.06%。

a-相对湿度70%; b-相对湿度80%图4 发酵黑蒜的可溶性糖含量变化Fig.4 Changes in soluble sugar content of fermented black garlic

2.2.2 总酸含量的变化

总酸含量随发酵时间延长显著升高(P<0.05)(图5),表明延长发酵时间会使黑蒜产品酸味增强。相对湿度为70%下发酵,总酸含量随发酵温度升高而升高,在相对湿度为80%下发酵6 d后则以75 ℃处理最高;表明高温低湿发酵会增强黑蒜产品酸味感。

a-相对湿度70%; b-相对湿度80%图5 黑蒜发酵中总酸含量的变化Fig.5 Changes of total acid content of black garlic in fermentation

2.2.3 游离氨基酸含量的变化

如图6,游离氨基酸含量随发酵时间延长呈先增后降趋势,这可能与蛋白质在湿热作用下水解生成氨基酸以及参与美拉德反应逐渐消耗有关。峰值多出现在第9 天,相对湿度为70%和80%时游离氨基酸峰值含量分别在0.74%～1.10%湿基和0.52%～0.58%湿基,说明较低湿度有利于游离氨基酸的积累。延长发酵时间不利于黑蒜鲜味品质特征。

a-相对湿度70%; b-相对湿度80%图6 发酵黑蒜游离氨基酸含量的变化Fig.6 Changes of free amino acid content in fermented black garlic

2.2.4 大蒜素含量的变化

如图7,大蒜素含量随发酵时间延长呈下降趋势。在相同相对湿度下,随发酵温度升高,大蒜素含量降低,其中相对湿度为80%时大蒜素含量水平总体低于相对湿度为70%;大蒜素含量适度下降有利于降低黑蒜产品的辛辣刺激性和苦味感[27]。

a-相对湿度70%; b-相对湿度80%图7 发酵黑蒜大蒜素含量的变化(%湿基)Fig.7 Changes of allicin content of black garlic in fermentation(% wet basis)

2.3 发酵黑蒜感官品质评价及发酵工艺选择

对前述不同相对湿度和温度的条件发酵6～15 d,合计24个样品采用模糊数学感官评价综合评判(图8)。8分以上9个样品,分值在8.00～8.45,含水量27.20%～44.95%(中值34.64%),可溶性糖30.87%～44.06%,游离氨基酸0.213%～0.798%,大蒜素含量0.045%～0.134%,这种波动表明感官品质受多种因素影响。

a-相对湿度70%; b-相对湿度80%图8 不同发酵时段黑蒜模糊数学综合感官评价得分图Fig.8 Fuzzy mathematics comprehensive sensory evaluation score chart of black garlic in different fermentation periods

从发酵时间看,发酵12 d分值在8.00～8.21的有4个样品,分别是相对湿度80%、75 ℃和相对湿度70%下温度在70～80 ℃,说明相对湿度为70%较好;发酵9 d受欢迎的有4个样品,分别是相对湿度为70%、75或80 ℃,或相对湿度为80%、75或80 ℃。兼顾品质和效率,选择相对湿度为70%、75 ℃下发酵9 d为发酵优化条件。

2.4 挥发性风味物质在黑蒜发酵中的变化

分析鲜蒜(FG)、超声波预处理大蒜(UG)和优化发酵工艺制备黑蒜(UBG)的挥发性风味物质变化,共检出31种挥发性物质。FG、UG和UBG分别检出19、19和17种挥发性物质;FG、UG以具有辛辣和蒜香风味的硫醚类为主,分别检出8种和7种,相对含量分别占75.78%和81.25%,以具有辛辣刺激的蒜香味的二烯丙基二硫醚占比最高,制备成黑蒜后,二烯丙基二硫醚占比有所下降,具有蒜香味的二烯丙基硫醚从原料的1.56%增加至43.44%,使黑蒜辛辣刺激性下降,同时具有洋葱和碳烤风味的噻烷类增加,还产生了具有蒜香和肉香味的2-乙基-1,3-噻唑烷-4-羧酸盐(表3)。

表3 超声波预处理及发酵黑蒜的挥发性成分种类及含量比较Table 3 Comparison of the types and contents of volatile components in ultrasonic pretreatment and fermented black garlic

2.4.1 挥发性物质的主成分分析

对样品中硫醚类、噻吩类、烷类、酯类、酸类及其他类挥发性物质相对含量进行主成分分析,得到各主成分的特征值、方差贡献率、累计方差贡献率,见表4,特征根λ1=3.835,特征根λ2=2.165,前2个主成分累计方差贡献率达100%,即涵盖了全部信息。

挥发性物质载荷分析如图9,相对含量最高的硫醚类风味物质与PC1高度正相关(载荷系数>0.8),其他含硫化合物为PC1中载荷最高的正相关挥发性物质(载荷系数>0.8),而酸类及烷类与PC1高度负相关(载荷系数<-0.8);PC2中载荷最高的正相关挥发性物质为噻吩类(载荷系数>0.8)。上述结果说明硫醚类、其他含硫化合物、酸类、烷类及噻吩类是FG、UG、UBG中含量发生显著变化的挥发性物质。

表4 主成分特征根和贡献率Table 4 Principal component characteristic root and contribution rate

图9 样品中挥发性物质的载荷分析图Fig.9 Looding plot of volatile substances in samples

样品得分如图10,FG、UG、UBG位于图中3个象限,表明它们之间有较大差异。UG及FG位于PC1中正半轴,在PC1中两者间差异不大;UBG位于PC1中负半轴,与UG、FG间有显著差异,具体体现在硫醚类、其他硫化合物、酸类及烷类挥发性物质的不同。在PC2中,UG与UBG位于正半轴,两者间差异体现在噻吩类挥发性物质的不同;FG位于负半轴,与UBG的差异体现在酯类挥发性物质的不同,与UG的差异体现在噻吩类挥发性物质的不同。

图10 样品的得分图Fig.10 Scoring plot of samples

具体看,UBG中,硫醚类占主导,相对含量最高的为二烯丙基硫醚(43.44%),较FG有极显著增加;相对含量次高的为二烯丙基二硫醚(26.89%),较FG有明显下降;其余硫醚类相对含量均较FG有明显降低。FG中3-乙烯基-4-烯-1,2-环己硫醚、二戊基二硫醚、3-乙烯基-5-烯-1,2-环己硫醚、烯丙基甲基二硫醚均未在UBG中检出,硫醚类物质种类较鲜蒜时减少,推测高温高湿发酵使FG中硫醚类化合物断裂和重排,引起各组分间相对含量变化,使黑蒜产品刺激性气味显著降低。黑蒜中增加较多的还有具蒜香和肉香味的2-乙基-1,3-噻唑烷-4-羧酸盐(9.63%)和1,3,5-三噻烷(5.66%),加上其他挥发性香气物质,共同构成了黑蒜特殊香气。

2.4.2 挥发性物质归类及气味贡献值分析

经对挥发性物质气味种类进行归类(图11),与FG、UG相比,UBG中新产生出果香甜味及酒香味物质,味道较浓郁的洋葱味与橡胶味的物质种类减少,呈刺激辛辣味的物质种类较FG与UG明显减少。

图11 挥发性物质的气味类型Fig.11 Odor types of volatile substances

查阅风味成分气味阈值并计算其气味贡献值(表5),显示从鲜蒜到黑蒜产品,具有刺激蒜味和硫磺味的二烯丙基三硫醚气味贡献下降,而具有辛辣刺激蒜香味的二烯丙基二硫醚、具有蒜香味的二烯丙基硫醚、蒜香和碳烤香味的1,3-二噻烷和2-甲基-1,3-二噻烷气味贡献度增加,还增加了具有果香甜味的丁酸苯乙酯和2-乙酰基呋喃。这些变化使黑蒜产品蒜香味突出,刺激及辛辣味明显降低,同时还有微弱的果香味、碳烤香味。

表5 主要挥发性物质的气味值及其风味描述Table 5 Odor value and flavor description of main volatile substances in black garlic

3 结论

含水量是黑蒜质感最重要指标,在相对湿度为90%条件下发酵蒜瓣含水量升高可导致大蒜发软,部分软烂,不宜作为发酵湿度条件。黑变是黑蒜最重要感官品质指标,提高温度可加快黑变,但高相对湿度为不利于黑变,结合蒜瓣感官色泽观察,色值>70可判断发酵黑变完成。

滋味成分分析显示,延长发酵时间和提高发酵温度均可提高黑蒜产品酸味感并降低甜鲜味感和辛辣刺激的苦味感。经模糊数学感官评价得到优化后的发酵工艺:相对湿度为70%,75 ℃下发酵9 d。以鲜蒜和超声预处理蒜瓣为对照,研究该最佳工艺发酵黑蒜挥发性风味品质特点,显示鲜蒜和蒜瓣以具有辛辣蒜味的硫醚类为主,制备成黑蒜后,具有辛辣刺激蒜味的二烯丙基二硫醚占比下降,具有蒜香味的二烯丙基硫醚增加,具有洋葱和碳烤风味的噻烷类增加,还产生了具有蒜香和肉香味的2-乙基-1,3-噻唑烷-4-羧酸盐。主成分分析和气味贡献值分析进一步确定了黑蒜产品特征香气为蒜香味,有碳烤和肉香味和微弱的果香味。