Hsa_circ_0000880在阿尔兹海默病患者血浆中的表达及诊断价值

崔 健，李婧静，李飞翔，李树强，朱洪山，朱 宁，闻 君，刘伟利，陈艳艳，吴 睿

郑州大学第二附属医院神经康复科 郑州 450014

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是世界范围内常见的神经退行性疾病，已成为老年人痴呆最常见的病因之一[1]。AD起病隐匿，患者认知和记忆功能持续恶化，出现行为异常、人格改变及社会行为混乱[2]。该病通常呈进行性加重，患者逐渐丧失独立生活的能力。AD的致死率和致残率很高，给家庭和社会带来了沉重的负担[3]。虽然AD的诊断和治疗已经有了一定的进展，但其分子发病机制仍未阐明[4]。对其潜在机制的进一步研究，可以帮助人们更加深刻地了解AD，以促进有效治疗策略的制定。

环状RNA(circRNA)是一类在大脑中富集的特殊单链非编码RNA[5]。circRNA具有共价闭合的连续环，无5’-3’极性以及poly(A)，可特异性吸附微小RNA(miRNA)，作为内源分子海绵，调控miRNA的表达，发挥其独特的生物学效应[6-7]。越来越多的证据表明，circRNA通过直接吸附miRNA，在包括AD在内的许多疾病的发病中发挥特殊作用。Wang等[8]发现circRNA-miRNA-mRNA网络参与了AD的发病过程。有研究[9]证实circRNA-7是miRNA-7分子海绵，调节散发性AD海马大脑中UBE2A和EGFR的代谢过程。Zhang等[10]发现miR-214-3p在SAMP8小鼠脑组织显著下降，与AD的发病机制有关，miR-214-3p对神经元凋亡和自噬有抑制作用。该研究分析了AD患者血浆及人神经母细胞瘤细胞中hsa_circ_0000880和miR-214-3p的表达,探讨hsa_circ_0000880作为AD诊断的生物标志物的可能性。

1 材料与方法

1.1 病例选择选取2018年5月至2019年5月在郑州大学第二附属医院就诊的AD患者28例(AD组)，年龄70～90(78.1±5.6)岁，男18例，女10例，诊断参照IWG-2[11]标准，排除急性心肌梗死、帕金森病、癌症和多发性硬化者[12-14]。招募28名健康人作为正常对照(对照组)，年龄70～90(77.4±5.9)岁，男18名，女10名。经常规检查、实验室检查、影像学检查、简易智力状态检查量表(MMSE)评分、蒙特利尔认知评估(MoCA)评分等，确定对照组的神经功能正常[15]。高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、高脂血症均根据现行临床标准[16-19]诊断。所有受试者均被告知受试目的并且签署知情同意书。本试验方案均经郑州大学第二附属医院伦理委员会批准。

1.2 血浆hsa_circ_0000880和miR-214-3p水平的qRT-PCR检测采集AD组及对照组受试者空腹8 h后的外周血2.5 mL，立即4 ℃条件下4 000×g离心15 min。分离后的血浆于-80 ℃保存。使用RNeasy mini kit(德国Qiagen公司)从血浆中提取总RNA。根据Circbank(http://www.circbank.cn/)获得的circRNA序列并扩增引物，利用反转录酶M-MLV(日本TaKaRa公司)合成第一链cDNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix(日本TaKaRa公司)进行hsa_circ_0000880检测。Hsa_circ_0000880上游引物序列5’-TCCGACAGAAAAGAGTGCGA-3’，下游引物序列5’-AATCCATAGCATCGAGCCCC-3’；内参GAPDH上游引物序列5’-GGCGATGCTG GCGCTGAGTAC-3’，下游引物序列5’- GAGGCTGT TGTCATACTTCTC-3’。反应体系共20 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL，上、下游引物及ROX Reference Dye Ⅱ各0.4 μL、DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。反应条件：预变性95 ℃ 2 min；变性95 ℃ 30 s, 退火及延伸60 ℃，30 s，共40个循环。使用Hairpin-it MicroRNAs定量PCR试剂盒(上海Gene Pharma公司产品)进行miR-214-3p检测。miR-214-3p上游引物序列5’-GCCGAGACAGCAGGCACA-3’，下游引物序列5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；内参U6 上游引物序列5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反应体系：2×Real-time PCR Buffer 10 μL,上、下游引物各0.3 μL，miRNA RT product 2 μL，Tag酶0.2 μL，加双蒸馏水至20 μL。反应条件：预变性95 ℃ 3 min；变性95 ℃ 12 s，退火/延伸58 ℃ 30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt方法分析hsa_circ_0000880和miR-214 -3p的相对表达水平。

1.3 细胞实验

1.3.1细胞和主要试剂 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和293T细胞购自美国 Type Culture Collection。293T细胞使用含体积分数15%胎牛血清和青霉素的高糖DMEM培养基培养，SH-SY5Y使用含体积分数15%胎牛血清及双抗的DMEM/F12培养基培养，培养条件均为37 ℃，体积分数5%CO2及体积分数95%相对湿度。Hsa_circ_0000880 siRNA(si-Circ)、对照siRNA(si-NC)、miR-214-3p mimic和对照miRNA(miR-NC)均购自中国上海GenePharma公司，双荧光素酶报告实验用载体pmirGLO和检测系统购自Promega(北京)公司，Lipofectamine 3000 购自美国Invitrogen公司。

1.3.2双荧光素酶报告实验 应用PCR法扩增从AD患者血浆中提取的包含miR-214-3p结合位点的的野生型hsa_circ_0000880片段(Circbank数据库预测)，并使用重叠扩增PCR法构建并扩增结合位点突变的突变型hsa_circ_0000880片段，然后将野生型或变异型hsa_circ_0000880分别克隆到pmirGLO载体得到pmirGLO-Wt-circ_0000880(Wt-circ_0000880)或pmirGLO-Mut-hsa_circ_0000880(Mut-circ_0000880)。根据说明书的方法使用Lipofectamine 3000 将载体和miR-214-3p mimic或miR-NC共转染至293T细胞，孵育24 h后，进行荧光素酶活性检测。

1.3.3抑制hsa_circ_0000880表达对SH-SY5Y细胞miR-214-3p表达的影响 SH-SY5Y细胞以每孔4×105个的密度接种于6孔板，分为si-Circ和si-NC组，每组设3个复孔，分别转染相应siRNA。使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司产品)进行转染，严格按照说明书操作。应用qRT-PCR法(同1.2)进行miR-214-3p表达的检测。实验重复3次。

1.4 统计学处理采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0分析。两组临床特征和血浆hsa_circ_0000880水平、si-Circ和si-NC组SH-SY5Y细胞中miR-214-3p表达的比较采用两独立样本t检验或χ2检验。采用ROC曲线评估hsa_circ_0000880对AD的诊断价值。AD患者血浆hsa_circ_0000880水平与MMSE、MoCA评分，miR-214-3p的相关关系采用Peason相关性分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组临床特征比较见表1。AD组MMSE和MoCA评分低于对照组。

表1 两组的临床特征比较

2.2 两组血浆hsa_circ_0000880水平比较AD组血浆hsa_circ_0000880水平为(2.967±0.886)，较对照组(1.539±0.558)明显升高(t=7.210，P=0.015)。

2.3 血浆hsa_circ_0000880对AD诊断的ROC曲线分析ROC曲线见图1。AUC为0.886，95%CI为0.773～0.999，取截断值为2.395时，其诊断的敏感度为73.7%，特异度为94.7%。

图1 hsa_circ_0000880诊断AD的ROC曲线

2.4 AD患者血浆hsa_circ_0000880水平与MMSE、MoCA评分相关性AD患者血浆hsa_circ_0000880水平和MMSE、MoCA评分呈负相关(r=-0.646和-0.601,P<0.001)。

2.5 AD患者血浆miR-214-3p与hsa_circ_0000880水平的相关性AD患者血浆miR-214-3p水平为(0.551±0.192)，与hsa_circ_0000880水平呈负相关(r=-0.053,P=0.002)。

2.6 双荧光素酶报告实验结果见表2。

表2 双荧光素酶报告实验结果(n=5)

2.7 抑制hsa_circ_0000880表达对SH-SY5Y细胞miR-214-3p表达的影响si-Circ组细胞中miR-214-3p相对表达水平为(2.362±0.162)，较si-NC组(1.000±0.052)升高(t=17.909,P=0.048)。

3 讨论

非编码RNA因其独特的生物学效应,可能与AD的病理机制(如淀粉样蛋白沉着病、突触缺失和神经元凋亡)有关[5，20]。Feng等[21]在AD患者血浆中发现LncRNA BACE1水平升高，BACE1可能成为预测AD的潜在生物标志物。有研究[11]表明经Aβ25～35蛋白诱导处理的SH-SY5Y细胞中miR-133b的表达下调，并且miR-133b可以作为特异性的生物标志用于AD的早期诊断，其敏感性高达90.8%。该研究结果显示AD患者血浆hsa_circ_0000880水平明显高于对照组。此外，hsa_circ_0000880诊断AD的ROC曲线的AUC为0.886，95%CI为0.773～0.999，截断值为2.935时，其敏感度为73.7%，特异度为94.7%，提示hsa_circ_0000880在诊断AD方面可能具有较高的价值。

MMSE和MoCA评分一般用于各类认知障碍和痴呆的初步筛查[22]。临床上通常联合检测两者，可提高认知障碍的检出率，提高认知筛查的准确性。一般来说，MMSE和MoCA得分越低，病情越严重[23]。该研究结果表明AD组患者血浆hsa_circ_0000880水平与MMSE/MoCA评分呈负相关，提示随着AD病情的加重，血浆hsa_circ_0000880水平呈上升趋势。

最近的研究表明circRNA-miRNA-mRNA网络在AD发生发展过程的许多方面起着关键作用。最近的研究[9，24]表明，ciRS-7-miRNA-7-ube2a通路在海马AD大脑组织中存在异常，表明了ciRS-7对miRNA-7的“海绵吸附作用”。Yang等[25]发现circ_0000950可以通过靶向调控miR-103，增加PTGS2的表达，从而抑制神经元增殖，促进神经元凋亡。Lu等[26]发现circHDAC9-miR-138-Sirt1在AD的认知损伤和病理过程中有潜在作用。本研究的双荧光素酶报告实验结果表明has_circ_0000880与miR-214-3p有靶向关系。基于以上发现，我们推测hsa_circ_0000880可能通过下调miR-214-3p的表达在AD的发生发展中发挥作用。

综上所述，AD患者血浆hsa_circ_0000880在水平升高，可能通过直接吸附miR-214-3p，参与AD的病理过程，hsa_circ_0000880可作为AD诊断的生物标志物。