血虚风燥型特应性皮炎患者血清差异表达miRNA生物信息学筛选

刘学伟，许孟月，王建茹，王海燕，王子雯

1)河南中医药大学第一临床医学院 郑州 450046 2)河南中医药大学第一附属医院皮肤科 郑州 450000

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种慢性复发性炎症性皮肤病，困扰着全球15%～20%的儿童和1%～3%的成年人[1]，在我国的发病率呈显著上升趋势[2-3]。AD主要表现为湿疹样皮炎伴顽固瘙痒，目前认为其发病与遗传、免疫、皮肤屏障功能障碍、微生物、环境等多种因素相关，但确切机制尚不清楚。现代研究[4]表明miRNA与AD的发病密切相关。中医证候反映了疾病发展某一阶段机体的病理变化，证候的出现可能与相关对应基因组的变化密切相关[5]。miRNA可通过调控靶基因参与各种生物过程使人体出现不同的症状与体征，miRNA特异性表达有可能为AD的诊断及中医辨证分型提供客观依据[6]。血虚风燥是AD的常见证候之一，目前关于血虚风燥型AD分子生物层面的研究较少，因此本研究利用高通量测序等分子生物学技术，筛选血虚风燥型AD患者与健康人血清差异表达的miRNA，挖掘血虚风燥型AD临床辨证分型miRNA标志物，为血虚风燥型AD的中医药防治及寻求干预靶点和环节提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象研究对象为2018年1月至2019年8月通过河南中医药大学第一附属医院网站、宣传海报形式招募的AD患者及健康志愿者。西医诊断根据文献[7]标准执行。中医诊断参照国家中医药管理局制定的《中医皮肤病证诊断疗效标准》中血虚风燥型四弯风的诊断标准[8]。纳入标准：符合AD诊断标准；符合血虚风燥证；年龄3～30岁；依从性好，自愿接受该试验并签署知情同意书。排除标准：妊娠或哺乳期妇女；伴有肝肾、心脑血管疾病，肿瘤，消化道、血液系统疾病等严重危及生命的原发性疾病及精神病患者；近1个月内应用糖皮质激素、免疫抑制剂类药物治疗及接受紫外线光疗者。本研究方案获得河南中医药大学第一附属医院伦理委员会审批通过。

1.2 miRNA高通量测序采用miRNA提取试剂盒(美国凯杰)提取血清中的miRNA。用Cubit(美国赛默飞)和Bioanalyzer(美国安捷伦)分别对提取的miRNA进行质量和完整性检测。采用Small RNA Library Prep Kit for Illumina文库构建试剂盒(南京诺唯赞)制备miRNA文库，在Illumina Hiseq 2500平台进行高通量测序。测序数据质量评估采用FastQC 0.10.1进行分析，使用二代测序数据质量统计软件Trimmomatic 0.30对测序原始数据去除接头以及低质量序列等，得到有效数据。

1.3 差异表达miRNA的筛选采用Trimmomatic软件对测序原始数据进行处理，得到合格序列，下载Rfam数据库序列，利用BlastN软件对序列进行比对，然后通过miRDeep2利用Reads比对信息进行注释并计算表达量。miRNA差异分析使用Bioconductor软件包的DESeq2 1.6.3进行分析。结果按照|log2FC|≥1.90且P<0.05进行筛选。

1.4 差异表达miRNA生物信息学分析选取上调与下调差异最大miRNA各3个进行靶基因预测及功能分析。为提高miRNA基因靶标预测的准确性，使用miRDB、Targetscan、miDIP分别预测miRNA的靶基因，并利用在线韦恩图(Venny)绘制工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)筛选出3个网站共有的靶基因，作为目标基因的靶基因。运用R 3.6.2软件ClusterProfiler包、Bioconductor包对靶基因进行GO分析和KEGG通路富集分析，设定P≤0.05为筛选条件。

2 结果

2.1 研究对象基本情况6例血虚风燥型AD患者年龄4～20(12.3±7.1)岁，男4例，女2例；6例健康志愿者年龄24～27(24.8±1.2)岁，男3例，女3例。

2.2 差异表达miRNA的筛选结果与健康人相比，血虚风燥型AD患者差异表达miRNA有74个(表1、2)，上调34个，其中表达前3位miRNA为miR-216b、miR-20b、miR-197；下调40个，其中miR-99、miR-1298-5p、miR-885是表达前3位的miRNA。

表1 上调miRNA列表

2.3 差异表达miRNA靶基因预测及生物信息学分析选取上调与下调差异最大的miRNA各3个(miR-216b、miR-20b、miR-197，miR-99、miR-1298-5p、miR-885)进行靶基因预测及功能分析。在miRDB、Targetscan、miDIP数据库分别得到了2 553、5 458、3 764个预测靶基因，通过Venny获得共同靶基因1 045个。运用R 3.6.2对1 045个共同靶基因进行功能注释，GO分析显示这些靶基因主要富集在17个功能，KEGG通路富集分析显示这些基因主要富集在10个通路上(表3、4)。

表2 下调miRNA列表

表3 miRNA靶基因富集的GO分析结果

表4 miRNA靶基因富集的KEGG分析结果

3 讨论

AD的疾病负担在非致命皮肤疾病中位列首位，然而AD的发病机制尚未完全阐明，与AD有关的重要基因和通路有待进一步研究。本研究对比了健康人与血虚风燥型AD患者血清中差异表达的miRNA，经鉴定获得了miR-216b、miR-20b、miR-197等34个下调的miRNA和miR-99、miR-1298-5p、miR-885等40个上调miRNA，显示了与健康人相比血虚风燥型AD患者血清差异性miRNA表达谱。中医认为血虚风燥型AD多因先天不足，禀赋不耐，脾失健运，复感风湿热邪，蕴聚肌肤，反复发作，病久不愈，耗伤津液，营血不足，肌肤失养所致。中医药在治疗AD具有自身特色及优势，在辨证明确前提下，可有效改善症状，提高患者的生活质量，降低复发率，且不良反应少。已有研究[9-10]表明AD存在特异性表达的miRNA，对疾病诊断具有一定指示作用，但均未涉及中医证候学。本研究中发现的差异表达miRNA可能成为协助血虚风燥型AD诊断的潜在生物标志物，为血虚风燥型AD的防治提供新的思路。

为了进一步了解这些miRNA及其靶基因在AD中发挥的作用，我们对上调与下调排名前3位的miRNA进行靶基因预测及生物信息学分析，GO分析显示这些miRNA的靶基因主要参与了调控基因的表达与转录以及蛋白质的结合等。KEGG分析显示差异表达miRNA被显著富集于TGF-β信号通路、Hippo信号通路、PI3K-Akt信号通路等。其中TGF-β信号通路对免疫稳态与免疫耐受起重要作用，TGF-β在特应性疾病中发挥重要作用，研究[11]发现与普通人群相比，具有TGF-β信号通路紊乱疾病的人群发生特应性疾病风险增加。TGF-β可以促进调节性T细胞的分化，刺激肥大细胞和Th9细胞的分化，参与过敏性疾病的进程[12]。此外TGF-β可刺激成纤维细胞产生细胞外基质蛋白和蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶的合成和释放，并促进成纤维细胞的激活，在伤口愈合和促进组织纤维化中起到重要作用，且TGF-β的过度表达与皮肤增厚有关[13]。此外，研究[14]发现母乳中较高水平的TGF-β可能与新生儿婴儿湿疹有关。本研究中纳入的血虚风燥型AD患者大多自婴幼儿发病，病程较长，其重要的皮肤改变为皮肤肥厚粗糙或苔藓样变，提示TGF-β信号通路可能与血虚风燥型AD存在联系。

综上所述，本研究采用高通量测序技术筛选了血虚风燥型AD患者的miRNA表达谱，并对差异表达miRNA进行了靶基因预测及功能分析，结果表明血虚风燥型AD差异表达miRNA可能通过调控TGF-β、PI3K-Akt、Hippo等信号通路参与AD的发生发展过程，这些差异表达miRNA有望成为诊断血虚风燥型AD的候选生物标志物。本研究尚存在一定的局限性，纳入样本量较少且研究对象均为河南地区人群，因此筛选出的差异表达miRNA辅助诊断血虚风燥型AD的效能仍需扩大样本和人群范围进一步确证；预测的miRNA靶基因和相关信号通路在血虚风燥型AD病理过程中的作用，尚需进一步进行验证。