氟化表面活性剂修饰硅胶色谱固定相制备及分离性能

乔晓强，聂扬扬，段立广，梁梦颖

(1. 河北大学 药学院，河北 保定 071002;2. 河北医科大学第一医院 药学部，河北 石家庄 050000)

梁梦颖(1993—)，女，河北保定人，河北大学硕士研究生，主要从事色谱分析研究.E-mail: 1296972375@qq.com

磷脂双分子层是生物膜的基本骨架，包含成千上万种独特的脂质结构，且极性差异大，丰度范围广，其中甘油磷脂的含量最高，约占所有脂类的(质量分数)75%[1-2].膜脂在细胞稳定和信号转导等方面发挥着重要作用[3]，膜脂稳态严重失衡与癌症、神经变性疾病、心血管疾病、肥胖、糖尿病和脂肪代谢障碍等疾病的发病机制息息相关[4].近年来，虽然对于膜脂潜在功能的了解越来越深入，但从分子水平上掌握全部膜脂信息还面临诸多挑战，需将膜脂研究从单纯的定性向精确的定量转变，而这依赖于高效的膜脂分离分析技术[5].

全氟键合硅胶色谱固定相自1980年被首次报道以来，在食品分析、药物分析和环境分析等领域显示了良好的应用潜力.近年来，不同类型的氟碳键合硅胶固定相、氟聚合物固定相以及氟化整体柱等不断得到开发和应用[6].含氟固定相在含氟/氟标记化合物分析中的应用最为广泛，这主要是基于氟-氟亲和作用[7].例如，Shan等[8]制备了基于1-乙烯基-3-五氟苄基咪唑溴盐的整体柱，其对氟代苯类化合物的分离选择性优于C18柱.Andre等[9]首次将氟化双壁碳纳米管动态吸附到二氧化硅上制备了新型色谱柱，用于1,3-二氟苯、1,3,5-三氟苯和1,2,4,5-四氟苯分离分析时，氟化双壁碳纳米管色谱柱比双壁碳纳米管色谱柱显示出更优异的分离选择性.近年来，含氟色谱固定相的应用得到了扩展.Todoroki等[10]利用氟分离技术，将合成的全氟烷基脯氨酸衍生物与商用氟色谱柱结合，制备了手性色谱固定相，将其成功应用于7种外消旋氨基酸的对映体分离[10].

含氟表面活性剂被称为“超级表面活性剂”，具有优异的热稳定性、化学稳定性和表面活性，并且与其他表面活性剂(如碳氢表面活性剂)有着极好的相容性[11-12].氟表面活性剂与碳氢表面活性剂间良好的复配性能，不仅可以降低氟表面活性剂的使用成本，还可为氟表面活性剂的使用开辟新途径[13].细胞膜上的磷脂是一类特殊的两性分子，其极性部分由磷酸连接不同的极性取代基团构成，非极性部分由饱和或不饱和碳氢链构成，因而磷脂分子是一种天然碳氢表面活性剂.为了改善磷脂的分离分析效果，本文探索将与磷脂分子具有良好相容性能的氟表面活性剂引入液相色谱固定相制备，期望能够增强复杂膜脂样品的分离分析性能，为膜脂的后续研究提供高效分离分析工具.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

二氧化硅(粒径5 μm，孔径12 nm)(上海大曹化工贸易有限公司)；(3-巯丙基)三乙氧基硅烷(MPS)(北京伊诺凯科技有限公司)；1-碘-1H,1H,2H,2H-全氟癸烷、1-乙烯基咪唑、偶氮二异丁腈(AIBN)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；二氯甲烷、三氯甲烷、环己醇、甲苯、异丙醇(天津市大茂化学试剂厂)；分析甲醇、色谱甲醇、色谱乙腈(ACN)(天津赛孚瑞科技有限公司)；醋酸铵(天津市科密欧化学试剂有限公司)；硫代乙酰胺、氰基乙酰胺、对氨基苯甲酰胺、烟酰胺、丙二酰胺(上海阿法埃莎试剂有限公司)；尿嘧啶、腺苷、胞苷、胞嘧啶(上海韶远化学科技有限公司)；2,6-二甲基苯胺、乙酰苯胺、邻苯二胺(上海阿达玛斯试剂有限公司)；色谱用纯水(法国Millipore公司的Milli-Q系统纯化)；二硬脂酰磷脂酰胆碱(PC标准品)、二油酰磷脂酰乙醇胺(PE标准品)(北京百灵威科技有限公司).

P230Ⅱ高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；ELSD6000蒸发光散射检测器(美国奥泰科技有限公司)；Nicolet iS10傅里叶变换红外光谱仪、TSQ Quantum Ultra质谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；STA449C热重分析仪(德国耐驰公司)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南省予华仪器有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)；GLK装柱机(无锡加莱克色谱科技有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 碘化1-乙烯基-3-全氟辛基乙基咪唑合成

在25 mL圆底烧瓶中，分别加入1-碘-1H,1H,2H,2H-全氟癸烷3.4 g(6 mmol)和1-乙烯基咪唑3.1 g(33 mmol)，通入氮气进行保护，将其置于80 ℃油浴中进行反应，待有沉淀析出时，停止反应并等待反应体系温度降至室温，用二氯甲烷多次离心洗涤至褐色固体产物变为白色，将得到的白色固体产物于60 ℃真空干燥24 h，得到碘化1-乙烯基-3-全氟辛基乙基咪唑(VIMF).

1.2.2 VIMF键合色谱固定相的制备

第1步：将干燥的硅球2.1 g悬浮于40 mL无水甲苯中，随后加入3.2 g MPS，混匀，在氮气保护下于110 ℃磁力搅拌反应24 h，反应结束并冷却至室温，所得产物经甲醇离心洗涤后于60 ℃真空干燥24 h，得到MPS修饰硅球(Sil-MPS).

第2步：在100 mL圆底烧瓶中，首先将1.9 g VIMF 超声溶解于10 mL甲醇中，随后向烧瓶中加入2.0 g Sil-MPS和40 mL甲醇，然后将20.8 mg AIBN溶解于1 mL甲醇，快速加入上述反应体系.反应物混匀，在氮气保护下，使其于65 ℃反应24 h.反应结束并冷却至室温后，依次使用甲醇、水-甲醇多次离心洗涤，将其置于烘箱中60 ℃真空干燥24 h，得到VIMF键合色谱固定相(Sil-VIMF)(图1).

图1 Sil-VIMF色谱固定相制备示意Fig.1 Scheme for fabrication the Sil-VIMF chromatographic stationary phase

1.2.3 色谱柱填充

称取Sil-VIMF色谱填料2.1 g，将其混悬于氯仿-环己醇(体积比9∶11)组成的匀浆液中.将混悬液缓慢倒入连接好空柱管(150 mm×4.6 mm)的匀浆罐中，将匀浆罐固定到装柱机上，在助推溶剂(异丙醇-甲醇，体积比为1∶1)的助推(压力为35 MPa)下填充30 min.装填结束，将系统压力缓慢降至0，静置15 min后，卸下色谱柱.安装好筛板、柱头后，用乙腈作为流动相冲洗色谱柱2 h，备用.

1.2.4 色谱分离条件

酰胺类物质、核苷和核碱基类物质和苯胺类物质的色谱分离，流动相条件：乙腈-水，1.0 mL/min，等度洗脱.紫外检测器条件：酰胺类物质和苯胺类物质，214 nm；核苷和核碱基类物质，254 nm.进样量为5 μL.

胃癌细胞膜脂提取物和磷脂标准品的色谱分离，流动相条件：含15 mmol/L乙酸铵的乙腈-水(体积比为50∶50)为流动相A，含15 mmol/L乙酸铵的乙腈-水(体积比为95∶5)为流动相B.蒸发光散射检测器条件：漂移管温度和雾化器温度均为100 ℃；载气(空气)为2.0 L/min；进样量为10 μL.

1.2.5 样品制备

酰胺类物质、核苷和核碱基类物质、苯胺类物质溶解在乙腈或水中，过0.45 μm滤膜，备用.酰胺类物质质量浓度为45～120 μg/mL；核苷和核碱基类物质质量浓度为70～250 μg/mL；苯胺类物质质量浓度为25～100 μg/mL. PC和PE标准品采用三氯甲烷-甲醇(体积比为2∶1)配制，过0.45 μm滤膜，备用.胃癌细胞由河北大学附属医院提供，膜脂的提取参照实验室之前的操作方法[14].

2 结果与讨论

2.1 Sil-VIMF色谱固定相表征

首先采用质谱仪对VIMF的结构进行表征.如图2所示，VIMF在正离子模式下出现质荷比为541.05的分子离子峰，说明VIMF已成功合成.

图2 VIMF的质谱Fig.2 Mass spectra of VIMF

进一步采用傅里叶变换红外光谱仪对Sil-VIMF色谱固定相进行表征.如图3a所示，在Sil-VIMF的红外光谱图中，出现了咪唑环中C=N伸缩振动吸收峰(1 570 cm-1)和烷烃-CH2变角振动吸收峰(1 460 cm-1)，证明了VIMF已被成功修饰到硅球上.同时采用热重分析仪对Sil-VIMF色谱固定相进行表征.如图3b所示，SiO2、Sil-MPS和Sil-VIMF在100 ℃左右的质量损失是其表面吸附的水分子损失所致.Sil-VIMF固定相材料在250 ℃左右质量损失迅速加剧，说明材料在250 ℃以下的稳定性良好.在780 ℃时，与Sil-MPS相比，Sil-VIMF的质量损失为13.7%，来源于键合到硅球上的VIMF的部分脱落.以上结果可进一步证明Sil-VIMF固定相材料成功制备.

图3 SiO2、Sil-MPS和Sil-VIMF的红外光谱(a)和热重分析(b)Fig.3 FT-IR spectra (a) and thermogravimetric analysis (b) of SiO2, Sil-MPS and Sil-VIMF

2.2 保留机制

采用酰胺类物质考察了Sil-VIMF色谱柱的保留机制.如图4所示，酰胺类物质在Sil-VIMF色谱柱上的保留随着流动相中乙腈体积分数的增加(70%增加至95%)而呈增强趋势，可见Sil-VIMF色谱柱对酰胺类物质的保留特性表现为亲水模式.

色谱条件：流动相为乙腈-水；流速为1.0 mL/min；检测波长为214 nm.图4 流动相中乙腈体积分数对色谱保留的影响Fig.4 Effect of ACN content in mobile phase on chromatographic retention

2.3 Sil-VIMF色谱柱分离性能

对于酰胺类物质，如图5所示，以乙腈-水(体积比为96∶4)作为流动相，在6 min以内，Sil-VIMF色谱柱可实现5种酰胺类物质的良好分离，拖尾因子为1.05～1.26，其中烟酰胺理论塔板数可达79 200 N/m.

色谱条件：流动相为乙腈-水(体积比96∶4)；流速为1.0 mL/min；检测波长为214 nm.1.硫代乙酰胺；2.氰基乙酰胺；3.对氨基苯甲酰胺；4.烟酰胺；5.丙二酰胺.图5 酰胺类物质在Sil-VIMF色谱柱上的色谱分离Fig.5 Separation chromatogram of amides on Sil-VIMF column

对于核苷和核碱基类物质，如图6所示，尿嘧啶、腺苷、胞苷和胞嘧啶4种物质在5 min内得到基线分离，出峰顺序依次为尿嘧啶(Log P：-1.09)、腺苷(Log P：-1.17)、胞苷(Log P：-2.24)和胞嘧啶(Log P：-0.9)，其中胞嘧啶的理论塔板数可达到71 200 N/m.从Log P值分析，亲水性依次增强的尿嘧啶、腺苷和胞苷在Sil-VIMF色谱柱的保留也逐渐增强，表现为亲水保留模式.与尿嘧啶相比，胞嘧啶的Log P值较大，疏水性较强，却在Sil-VIMF色谱柱表现为强保留，可能是由于在乙腈-水流动相条件下，与尿嘧啶中的羟基相比，胞嘧啶上的氨基具有一定碱性，由于硅胶基质固定相材料之间静电作用导致的.

色谱条件：流动相为乙腈-水(体积比85∶15)；流速为1.0 mL/min；检测波长为214 nm.1.尿嘧啶；2.腺苷；3.胞苷；4.胞嘧啶.图6 核苷和核碱基类物质在Sil-VIMF色谱柱上的色谱分离Fig.6 Separation chromatogram of nucleosides and nucleobases on Sil-VIMF column

对于苯胺类物质，如图7所示，2,6-二甲基苯胺、乙酰苯胺和邻苯二胺3种物质在Sil-VIMF色谱柱上的保留时间随其亲水性增强而增加，并在4 min内实现基线分离，乙酰苯胺的理论塔板数可达到60 000 N/m.

色谱条件：流动相为乙腈-水(体积比98∶2)；流速为1.0 mL/min；检测波长为214 nm.1.2,6-二甲基苯胺；2.乙酰苯胺；3.邻苯二胺.图7 苯胺类物质在Sil-VIMF色谱柱上的色谱分离Fig.7 Separation chromatogram of anilines on Sil-VIMF column

2.4 Sil-VIMF色谱柱用于胃癌细胞膜脂提取物分离分析

胃癌是世界上第五大癌症类型和第三大癌症死亡原因[15].癌症与磷脂的改变息息相关，进一步将Sil-VIMF色谱柱用于胃癌细胞膜脂提取物分离分析，如图8所示，相同色谱条件下，在PC和PE标准品的出峰位置，胃癌细胞膜脂提取物的色谱图中各出现一组色谱峰，说明胃癌细胞膜中可能存在多种不同类型的PC和PE分子.后续研究将进一步结合质谱分析，对上述色谱峰进行结构鉴定.

色谱条件：流动相为A-B(体积比20∶80)，其中A相为含15 mmol/L乙酸铵的乙腈-水(体积比50∶50)，B相为含15 mmol/L乙酸铵的乙腈-水(体积比95∶5)；流速为1.0 mL/min；ELSD检测.图8 PC、PE标准品和胃癌细胞膜脂提取物在Sil-VIMF色谱柱上的色谱分离Fig.8 Separation chromatogram of PC, PE standards and gastric cancer cell membrane lipids extract on Sil-VIMF column

3 结论

以1 -乙烯基咪唑和1-碘-1H,1H,2H,2H-全氟癸烷为原料合成了含氟表面活性剂VIMF，并以VIMF为单体，利用巯基-烯点击反应，制备了VIMF键合硅胶色谱固定相Sil-VIMF.Sil-VIMF色谱固定相具有典型的亲水作用色谱保留机制，其柱效可达79 200 N/m.Sil-VIMF色谱柱可有效分离胃癌细胞膜中的磷脂分子，在膜脂分离分析中具有一定的应用潜力.