转录组数据挖掘技术在单萜生物合成相关基因分析中的应用

严珂宇

摘要：东紫苏ElsholtziabodinieriVaniot为唇形科香薷属植物，又名小山茶、小香薷、凤尾茶等，主产于云南、贵州西部。全草入药，味苦、辛，性平，具有发散解表、清热利湿的功效，用于感冒、咽喉痛、头痛、扁桃腺炎、小儿口腔炎、牙痛、眼结膜炎、肝炎、消化不良等症，是一种常见的彝药。在滇南一带以及滇中、滇西部分地区，东紫苏的嫩叶或全株在民间被用来当茶饮已有悠久的历史，有清热解毒之效。

关键词：转录组;数据挖掘;东紫苏单萜生物合成;相关基因

引言

紫苏主要分为9种化学型，主要依据紫苏醛、柠檬烯、紫苏酮、异白苏烯酮、紫苏烯、香薷酮等单萜的百分含量变化进行划分。由此可见化学型的划分主要是依据主成分含量的变化规律，因此本研究根据东紫苏叶挥发油主成分1，8-桉叶油醇、α-乙酸松油酯及α-蒎烯、β-蒎烯含量的变化规律来划分化学型是合理的。

1东紫苏的概述

东紫苏（ElsholtizabodinieriVaniot）又名凤尾茶、小山茶、云松茶、牙刷草、野山茶等，来源于唇形科（Lamiaceae）香薷属（Elsholtzia），主要分布于我国的云南、贵州省西部，四川、甘肃、青海等地区也有分布。东紫苏全草入药，味辛，性平，有发散解表、清热利湿、理气和胃的功效，用于外感风寒、头疼身痛、咽喉痛、虚火牙痛、消化不良、急性结膜炎等症。在云南民间有用其干燥嫩叶或全株泡水或煮水作为清热解毒茶饮的传统和习惯，是一种重要的民族民间药。东紫苏除挥发油外还含有黄酮类、三萜类、酚类等成分。对采自云南开远的东紫苏进行研究，发现黄酮含量较大（约为10%），叶部是黄酮主要存在部位，较少存在于根部。黄酮成分最高的3个化合物分别为圣草素7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷（含量最高，达5.1%），木犀草素7-O-β-D葡萄吡喃糖苷、山柰酚3-O-芦丁糖苷。三萜类化合物主要集中在东紫苏的茎部和根部（0.142%～0.189%），其中齐墩果酸类化合物为三萜类的主要成分（0.074%～0.197%）。东紫苏含有迷迭香、没食子酸、香草醛、咖啡酸、香草酸、甾醇、倍半萜、二萜苷和多种铁、锰微量元素。

2.单萜类化合物的研究意义

单萜类化合物易被人体吸收然后转移到血液中，具有治疗多种疾病的功能。例如，左旋薄荷醇具有镇咳、抑菌等作用，外用可以清凉止痒，内服可以治疗头痛及鼻咽喉炎症等。香叶醇是一种无环单萜，具有玫瑰香气和广泛的药理作用，常被用于香水、化妆品、临床抗癌药物的生产，其价格为522元/100g，市场需求量也较大，根据新思界产业研究中心发布的《2020-2025年中香叶醇市场分析及发展前景研究报告》显示，预计2025年中国香叶醇需求量将达到1000t。某些单萜烯及其衍生物，如单萜蒎烯和柠檬烯，具有较高的燃烧热值、较低的凝固点，使它们可以成为汽油、柴油等传统燃料的环保替代品。此外，还有一些单萜类化合物，如香芹酚和香叶烯，对微生物和昆虫的毒害作用比较大，因此经常被用作抗生素和杀虫剂。因此，单萜化合物的高效合成在工业、农业、医药等领域都具有重要的意义。

3.东紫苏挥发油的提取注意事项

单萜合酶基因克隆成功率低，并且转录组注释的功能信息与东紫苏挥发油GC-MS数据分析结果不吻合，即注释的功能与挥发油的成分并不匹配，推测是受测序技术所限，以及数据库可供比对的基因资源有限，增加了功能注释的难度，致使一些东紫苏挥发油单萜合成相关的关键酶基因未能得到精准拼接、组装和注释。此外，由于相同物种来源的单萜合酶的相似性高于不同物种来源而具有相同功能的单萜合酶，序列相关性并不直接轉化为产物相关性，因此基于序列相似性仅可以判断其是否为单萜合酶，却不能预测其产物，所以已经克隆成功的6个单萜合成相关候选基因需要进行功能验证，确认其在东紫苏挥发油单萜生物合成过程中的催化功能，才能确定该酶属于哪一种单萜合酶，以便最终得到东紫苏1，8-桉叶油醇合酶基因。

4.东紫苏挥发油的提取

不同产区的东紫苏挥发油从含量到成分组成有区别，原因可能来自以下几方面。（1）东紫苏来自不同产区;（2）提取方法的不同得到不同化学成分的挥发油，有学者[39]认为水蒸汽蒸馏法提取的主要成分为桉素油（25%）;CO2-SFE提取得到的主要为氧化石竹烯和4-（1-甲基乙基）-苯甲醇，相对含量分别为5.57%和6.83%，而桉素油的相对含量仅为2.24%;（3）药材的部位不同或者使用鲜品、干品的不同造成挥发油含量和成分的不同;（4）采收季节或时间的不同。因此，有必要在同一实验条件对来自不同产地的东紫苏挥发油进行研究，从而发现不同产区东紫苏挥发油含量及成分的异同。目前降血脂、抑菌活性、抗氧化和防衰老是东紫苏的现代药理学热点，但文献中记载的发散解表、清热利湿、理气和胃功效的药效药理学研究较少。东紫苏在民间长期饮用的历史悠久，应首先对其进行安全性评价，从而为其食品饮料、药物制剂开发和临床合理运用提供科学依据。

5.单萜类化合物上游合成途径的强化

碳源进入微生物体内被代谢合成IPP和DMAPP的过程。在原核生物中可通过自身的MEP途径合成：以丙酮酸（Pyruvate）和3-磷酸甘油醛（DL-Glyceraldehyde3-phosphate，G3P）为前体，在5-磷酸脱氧木酮糖合成酶（1-Deoxy—D-Xylulose5-PhosphateSynthase，Dxs）催化下缩合形成脱氧木酮糖-5-磷酸（1-Deoxy—D-Xylulose5-Phosphate，DXP），5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（1-Deoxy—D-Xylulose5-Phosphatereductoisomerase，Dxr）催化DXP发生分子内重排和还原反应生成甲基赤藓醇-4-磷酸（MEP）。随后，MEP经4-二磷酸胞嘧啶-2-甲基赤藓糖醇合酶（2-C-methyl-D-erythritol4-phosphatecytidylyhransferase，Ispd）、4-二磷酸胞嘧啶-2-甲基赤藓糖醇激酶（2-C-methyl-Derythritol-4-phosphatekinase，Ispe）、甲基赤藓醇-2，4-环焦磷酸合酶（2-C-methyl-D-erythritol-2，4-cyclodiphosphatesynthase，Ispf）、甲基赤藓醇-2，4-环焦磷酸还原酶（2-C-methyl-D-erythritol-2，4-cyclodiphosphatereductase，Ispg）和羟甲基-丁烯-4-焦磷酸还原酶（Hydroxy-2-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphatereductase，Isph）五个酶的催化反应生成IPP和DMAPP。在真核生物中则是通过内源的MVA途径进行合成：乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）在乙酰乙酰辅酶A硫解酶（Acetoacetyl-CoAthiolase，Erg10）的催化作用下生成乙酰乙酰辅酶A，乙酰乙酰辅酶A在羟甲基戊二烯辅酶A还原酶（Hydroxymethylglutaryl-CoAsynthase，Erg13）的催化作用下生成羟甲基戊二酰辅酶A（Hydroxymethylglutaryl-CoA，HMG-CoA），HMGCoA接下来被羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（Hydroxymethylglutaryl-CoAreductase，Hmgr）还原生成甲羟戊酸（MVA），甲羟戊酸在甲羟戊酸激酶（Mevalonatekinase，Erg12）、磷酸甲羟戊酸激酶（Phosphomevalonatekinase，Erg8）、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（Mevalonatepyrophosphatedecarboxylase，Mvd1）以及异戊烯焦磷酸异构酶（Isopentenyldiphosphateisomerase，Idi）的催化作用下生成IPP和DMAPP。然而，由于仅通过微生物自身的内源反应合成的单萜产量远不足以用于工业生产，因此，研究者通过设计和改造微生物的内源代谢途径或者引入异源代谢途径来优化上游途径模块，以获得更多的前体物质，从而强化微生物细胞中目标单萜类化合物的生产能力。

结束语

挥发油不同化学型可能具有不同的药理活性，后续研究将关注东紫苏叶挥发油不同化学型的药理活性，同时将进行挥发油单萜合酶生物合成途径的相关研究，为东紫苏种质资源评价筛选和品种选育提供理论指导。

参考文献

[1]毛媛.东紫苏中木犀草苷的分离及其生物活性研究[D].上海海洋大学，2016.

[2]毛媛，刘克武，刘克海，许剑锋，吕慧.东紫苏化学成分研究概述[J].中国中医药信息杂志，2016，23（03）：134-136.

[3]毛媛，吕留庄，刘克武，刘克海.东紫苏（ElsholtizabodinieriVaniot）总黄酮的提取及其抗氧化、免疫活性的研究[J].食品工业科技，2016，37（09）：85-88.