湛江地区凡纳滨对虾肝肠胞虫检出实例分析

谢艳辉，李家侨，斯泽恩，郑舒尹，廖金湾，张娜

（湛江海关技术中心，广东 湛江 524000）

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei, EHP）属于微孢子虫科，肠胞虫属，最早在泰国生长缓慢的斑节对虾（Penaeus monodon）中发现[1]，2009 年首次被分离和命名[2]。与之前所报道的感染对虾的微孢子虫不同，EHP 只侵染对虾肝胰腺组织，可感染斑节对虾和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）等养殖虾类。自2009 年被分离与命名后，EHP 成为近年来影响全球对虾养殖生产较严重的疾病之一，亚洲的EHP 在凡纳滨对虾中已达到流行病学程度[3]，我国也有很多报道。2015 年，江苏地区在全年较少发生白斑综合征的情况下，由于EHP 导致一半的养殖户亏损，EHP 已成为影响我国沿海地区凡纳滨对虾产业发展的一大障碍[4]。2016—2017 年我国粤西地区[5]、辽宁[6]及浙江舟山[7]的凡纳滨对虾中 EHP 均有较高的检出率。刘珍等[8]利用荧光PCR 方法对采自山东、江苏和海南的凡纳滨对虾进行EHP 检测，结果表明当对虾肝胰腺中EHP 的SSU rDNA 相对拷贝数在103copies/（ng HpDNA）数量级或EHP 载量指数在3 以上时与体长呈负相关。以上报道均表明该病致死率不高，但会导致对虾生长缓慢。

目前对EHP 的检测技术包括普通PCR 方法[9-10]、环介导等温扩增方法[11]及荧光PCR 方法等[8]。Thitamadee 等[3]通过不同方法比较认为，巢式PCR 是最优的检测EHP 的方法。由农业农村部渔业渔政管理局等单位编写的《2019 我国水生动物重要疫病状况分析》提到，EHP 在养殖虾较密集的湛江地区检出率较高，但目前对于EHP 的发生与环境因子的关系研究较少，为了解EHP 与养殖环境的关系，2020 年4 月，采集了不同养殖场的凡纳滨对虾样品，采用巢式PCR 方法检测EHP，同时收集不同的养殖环境数据，对EHP 与环境因子的相关性进行分析。此次检测为我国对虾EHP 的流行病学分析提供了重要资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验池塘 为了解不同养殖模式下EHP 与环境因子的关系，选取湛江地区凡纳滨对虾养殖基地两口高位池（标记为G1、G2）和两口低位池（D1、D2）为试验池塘。所有的池塘均无混养，放苗前期均有培藻，养殖过程中均需每天换水约5 cm 深。池塘规格及虾苗放养情况见表1。

表1 试验池塘基本情况

1.1.2 仪器及试剂 仪器：HI9828 多参数防水型水质测定仪，PCR 扩增仪（美国ABI 公司），凝胶成像仪（德国Biometra 公司），高速冷冻离心机（Eppendorf centrifuge 5417R），电泳仪（DYY-8C，北京市六一仪器厂）。

试剂：10×PCR buffer（Mg2+ Plus），TaqDNA 聚合酶，dNTP、DNA 分子质量标准物DL2000，琼脂糖，均为大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集及各环境指标的分析测定 连续一周采集不同虾池的养殖水样，现场测量水温、盐度、pH 值和溶解氧（DO），并于第 7 d 采集虾样,分别密封后冷冻保存运回实验室进行分析，虾样分别标记为G1X、G2X、D1X 和D2X。取虾样的肝胰腺组织约100 mg 放入离心管中，加入1 mL 的PBS溶液（浓度0.1 mol/L）研磨破碎后离心，取上清液备用。

1.2.2 核酸提取 采用ABI 公司生产的核酸提取试剂盒（MagMAXTM-96 DNA Multi-Sample Kit）进行抽提，样品为50 μL 离心后的上清液。

1.2.3 nested-PCR 所用引物参考文献[10]，引物序列、扩增体系及扩增程序如下。

（1）套式PCR 第一步。在PCR 反应管中，依次加入试剂：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，引物ENF779 和 ENR779 各 0.5 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，模板 5 μL，然后加水至 25 μL，混匀后低速离心，使液体集中在底部。按照以下程序进行扩增：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，68 ℃45 s，30 个循环；68 ℃延伸 5 min。（2）套式 PCR第二步。在PCR 反应管中，依次加入以下试剂：10×PCR buffer（Mg2+Plus）2.5 μL，引物 ENF176 和ENR176各0.5 μL，dNTP（10 mM）2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.5 μL，第一步 PCR 反应产物 1 μL，然后加水至25 μL，混匀后低速离心，使液体集中在底部。按照以下程序进行扩增：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，68 ℃ 45 s，35 个循环；68 ℃延伸 5 min。

1.2.4 数据处理 本试验数据处理及作图主要采用Excel 软件。

2 结果与讨论

2.1 养殖水理化指标

2.1.1 各养殖场理化因子变化情况 各养殖场温度、盐度、pH 值和 DO 变化见图 1（a）（b）（c）（d）。

由图1（a）可见，总体上高位池温度比低位池高，高位池温度为 24.12～27.08 ℃，第 3 d 采样期间下雨，温度稍有下降，随后基本稳步上升，低位池温度为24.02～25.57 ℃，随着采样时间变化基本上为上升状态。由图1（b）可见，高位池盐度显著高于低位池，高位池盐度为28.32～30.32，低位池盐度为5.46～6.69，各池塘内盐度基本上稳定，变化不大。由图1（c）可见，随着养殖时间增加，总体看来，低位池 pH 值比高位池低，高位池 pH 值为 5.43～7.25，第4 d 稍有上升，随后下降，低位池pH 值为3.64～7.70，随时间变化基本呈下降趋势。由图1（d）可见，总体看来，高位池DO 浓度比低位池高，高位池ρ（DO）为 24.12～27.08 mg/L，第 3 d 由于下雨，导致水体中光合作用降低，ρ（DO）下降，随后逐步上升；低位池 ρ（DO）为 24.02～25.57 mg/L，随时间变化呈上升趋势，但总体较为平稳。

图1 各养殖场温度、盐度、pH 值和DO 变化情况

2.1.2 各因子差异分析 采用单因素方差分析的方法分别对相同养殖方式的池塘及不同养殖方式的池塘的温度、盐度、pH 值和ρ（DO）进行差异分析，结果见表2 和表3。由表2 和表3 可见，相同养殖方式的池塘各因子均没有显著差异（P＞0.05），而不同养殖方式的池塘温度、盐度和ρ（DO）差异极显著（P＜0.05），pH 值没有显著差异。

表2 各池塘间理化因子差异分析

表3 高、低位池理化因子差异分析①

2.2 病原检测结果

2.2.1 肝肠胞虫套式PCR 试验结果 取7 μL 反应产物加入1%琼脂糖凝胶内进行电泳，结果如图2所示。4 个样品在PCR 第一步没有出现条带，PCR第二步反应出现了176 bp 的条带，同阳性对照条带一致。

图2 巢式PCR 产物电泳结果

2.2.2 扩增产物测序与序列同源性比对 PCR 扩增条带经上海英骏生物技术有限公司测序，结果同GenBank 中参考序列进行比对，与EHP 同源性为100%，可确认4 个样品结果均为EHP 感染。

2.3 讨论

研究所选取的4 口池塘内对虾均表现出一定的生长缓慢特性，结合病原检测可以确定为EHP感染，不同养殖方式的理化因子差异显著，盐度、pH 值范围跨度较大，但是均检测出EHP，说明EHP对于外部环境可能具有较高的适应性，水质变化不影响其生长传播。目前对于水质与EHP 相关性的研究较少，陈晓玲等[12]对日照地区养殖凡纳滨对虾流行EHP 病情况进行了调查，发现EHP 的爆发与养殖池中水质变化无直接关系，与本研究结果一致。本研究只选取了4 口池塘进行了短期的跟踪研究，不具有代表性。后续若需进一步了解EHP 与养殖环境的关联性以及EHP 的流行病学特征，还要进行大量、长期的试验调查工作，结合相关数据进行综合分析。

EHP 体长以μm 计，主要寄生于对虾肝胰腺小管上皮细胞中，EHP 导致受感染的对虾生长停滞，个体大小差异明显，且会导致细菌的继发感染。在泰国养殖的感染白便综合征的凡纳滨对虾中，EHP 检出率较高。但人工感染实验证明，EHP并不会导致白便综合征[10]。陈禄芝等[5]、王雅博等[6]和刘宝彬等[13]均发现EHP 与传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）混合感染比例较高，可能是由于两种病原均感染的是对虾的组织器官，其中一种感染造成器官的病变后，另一种病原更易入侵。凡纳滨对虾感染以上两种病原后均未死亡，表现的症状均为发育迟缓，因此极易将EHP当成IHHNV。另有研究表明，EHP 的感染主要发生在几种病毒或是淋巴器官及造血组织的病原体感染中，健康的小虾被感染的相对较少[2]。结合之前研究结果，EHP 主要导致对虾生长缓慢。据调查得知，本研究中的虾苗还出现了一定数量的死亡现象，根据EHP 和IHHNV容易造成对虾混合感染的事实可推断，虾苗的死亡可能是多种病原并发感染导致。目前以上几种病原的检测技术都已经很成熟，在养殖过程中出现症状应当及时进行病原检测，好对症下药，及时止损。

EHP 可进行垂直和水平传播。水平传播指通过携带EHP 的水体和取食病虾残体使健康虾感染[10]，或通过摄食携带EHP 的鲜活饵料使孢子体在对虾中传播[14-16]；垂直传播指感染了EHP 的亲本虾将EHP 传染给子代[17]。有研究表明，该病主要来源于活饵料（如多毛类）的应用，因为在亚洲本地或进口的活饵料中均检出了EHP 阳性，主要是因为养殖场在标粗过程中将虾苗在不同的养殖池内转移，处理不当的养殖池中可能存在EHP[3]，EHP 感染对虾后，在肝胰腺细胞内形成胞原质，成熟后可通过消化道排出体外，散于水体并附着于藻类等表面，威胁健康对虾。Salachan 等[16]将感染了EHP 的对虾与健康对虾放入一个共生系统，发现EHP 对健康对虾有100%感染率。由表1可知，目前不同养殖模式下的养殖密度均较高，尤其是高位池。目前我国凡纳滨对虾养殖量很大，一旦有虾感染了EHP，在如此高密度养殖池中，EHP 的传播将很难得到控制，因此从源头控制十分必要。

3 结语

通过对凡纳滨对虾养殖水体理化因子的连续监测，以及对养殖对虾的病原检测，发现EHP的传播、发生与养殖池中水质变化无直接关系。EHP 感染虽未导致对虾死亡而仅是影响其生长，但该病多与其他疫病并发感染，从症状上很难判断是否感染EHP，且造成的损失十分巨大，因此早进行病原检测有助于早发现早治疗。目前EHP 不在世界动物卫生组织（OIE）疫病名单上，我国农业农村部也未将其列入《一、二、三类动物疫病病种名录》，究其来源，进口的无特定病原体（SPF）种虾及饵料也可能携带EHP，供应商或检疫机构应将该病放入SPF 检疫名单[3]。就目前该病在我国流行情况看来，建议及早制定相应的检疫措施和相关标准，并将该病列入我国检疫性水生动物疫病名单。