基于Meta 分析解析羊肠道细菌优势菌群

王 彤，刘 倩，严 慧，纪守坤，刘 萱，朱美玉，王亚越，刘月琴，张英杰

（河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000）

肠道微生物在刺激新生反刍动物肠道免疫系统建立[1]、参与宿主免疫调节方面发挥重要作用[2]，在动物后肠段营养物质降解利用方面也具有重大意义，羊盲肠微生物发酵产生的挥发性脂肪酸占总产量的12%[3]。细菌作为肠道菌数量最大的一类，其多样性极高，目前已分离鉴定的细菌包括53 个门、26 024 个种[4]，肠道细菌群落受饲料[5-6]、饲养方式[7]、季节[8]和遗传[9]等多因素影响，不同研究中所获得的群落多样性各异，导致研究者对羊肠道微生物群落结构的认知产生争议。Smith 等[10]研究发现，优势物种在维护生物群落稳态方面发挥重要作用，动物胃肠道内的优势菌往往会决定动物机体的采食[11]和免疫[12]等功能，也更容易在肠道中定植生存。因此，肠道中的优势菌群可能也在维护肠道微生态平衡中发挥重要作用，对羊肠道优势菌群进行研究对其肠道微生态调控具有重要意义。

Chang 等[13]研究发现，羊肠道菌以密螺旋体属（Treponema）为绝对优势属，其次有琥珀酸弧菌属（Succinivibrio）和5-7N15。Zhang 等[14]研究发现，小尾寒羊肠道以拟杆菌属（Bacteroides）、瘤胃球菌属（Rumi nococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostri dium）和黄杆菌属（Flavonifractor）为主。研究结果的差异可能与动物个体差异及样本过少等因素有关，羊肠道具有普适参考性的优势菌类型及其丰度区间仍不明确。

Meta 分析能够有效综合同一研究内容的不同独立研究结果，利用系统定量的统计方法，对已发表文献中的同类数据进行合并分析，获得全面性的结论，已形成一套严谨的流程，在医学、生态学等领域广泛应用。因此，本研究采用网状文献检索和Meta 分析法结合，通过对大量文献的丰富数据进行统计，得到羊肠道优势菌群的有效丰度区间，从而达成系统性的评价和描述羊肠道优势菌群及其丰度区间的目的，为羊肠道常驻优势菌的研究提供有力的证据和合理的参考。

1 材料与方法

1.1 文献检索与筛选标准 研究对象为健康羊的优势菌群种类和丰度。采用中国期刊全文数据库（CNKI）和Web of Science 2 个平台，并通过追查已纳入文献的参考文献进行检索。检索时间区间为建库到2021 年3 月5 日。在中国知网等中文数据库中，以主题词“羊”、“肠道”、“菌群结构”、“菌群”、“微生物”、“消化道”和“肠道细菌”进行检索。在Web of Science 外文数据库中，以主题词“sheep”、“Goat”、“Lamb”、“Bacterial Community”、“Intestinal Tract”、“Intestinal Flora”和“Microbiota”进行检索。

1.2 文献纳入与排除标准 纳入指标：①英文和中文文献；②结局指标：菌群种类、数量、丰富度与多样性；③试验动物为断奶后的羊。排除标准为：①只能获取摘要且无法与作者获得联系的文献；②研究对象不符合的特殊样本（哺乳期羔羊；瘤胃菌群；小肠菌群）；③数据不全的文献（结果和附表中只有图或文字表述，未给出门或者属的具体丰度信息；未给出SD、SE 或SEM值）；④未公开发表，重复报道或信息不完整的文献；⑤综述、个案报道或基础研究等类型的相关文献。

1.3 资料提取 由研究者进行资料的提取并反复核对，信息提取由研究特征、研究对象的特征和结局指标3 部分组成，包括作者、发表时间、实验方法、研究对象类别、样本量、试验组、对照组、微生物丰度、标准误等。

1.4 统计分析 采用R-4.0.0 软件进行方差倒数法Meta分析，合并效应量为微生物丰度，计算合并之后的点估计值及95%的可信区间（CI）。若原始数据只提供中位数、标准差SD 及样本量N，通过公式计算标准误SE。利用I2和P 进行综合判断是否存在统计学异质性，P＞0.1，I2＜50%，表示存在同质性或异质性很小，采用固定效应模型；P＜0.1，I2＞50%，表示存在较大异质性，采用随机效应模型。使用R-4.0.0 软件绘制漏斗图评价发表偏倚，Thompson 算法计算偏倚显著性，P＜0.05，不对称漏斗形表明可能存在发表偏倚；P＞0.05，对称的漏斗形则表示不存在发表偏倚。

2 结果与分析

2.1 文献检索和筛选 本研究经过初步检索共获得相关文献1 413 篇，在简单阅读摘要后剔除重复文献和不符合要求的文献640 篇，通过阅读文章内容，排除602 篇（包括文献综述43 篇，观察性实验108 篇，菌种致病研究234 篇，治疗方案201 篇，会议、报纸等16 篇），获得38 篇文献，阅读试验内容和结果，进一步剔除不符合要求的文献23 篇（包括结局指标不符的文献14 篇，主要试验动物不符的文献3 篇，叙述性文章5 篇），最终获得12 篇文献（包含7 篇中文文献，5 篇英文文献），纳入Meta 分析。

2.2 纳入文章的基本特征 纳入12 篇文献，共包括233只试验羊。所有纳入文献均提到随机分组，本研究关注的产出指标为优势菌群丰度，纳入的12 篇文献中，包含门类水平优势菌的有10 篇，包含属类水平优势菌的有10 篇，文献信息见表1。

表1 12 篇羊肠道菌群文章信息

2.3 门水平优势菌丰度 如表2 所示，羊肠道以厚壁菌门和拟杆菌门为绝对优势门，丰度点估计值分别为56.76%和28.64%，95%置信区间分别为（53.70%，59.81%）和（25.15%，32.13%）。螺旋体门丰度点估计值为2.37%，变形菌门为2.06%，放线菌门为0.69%。

2.4 属水平优势菌丰度 羊肠道优势菌属丰度及95%置信度区间见表2。拟杆菌属是羊肠道的优势菌属，丰度点估计值为4.33%，95%置信区间为（3.13%，5.53%）。密螺旋体属丰度点估计值为2.49%，瘤胃球菌属为1.60%，普氏菌属为0.67%，丁酸弧菌属为0.30%。

表2 羊肠道优势门和属的meta 分析结果

2.5 发表偏倚评估 如图1 所示，羊肠道拟杆菌门和厚壁菌门丰度指标漏斗图对称性好，P值分别为0.16 和0.90，不存在发表偏倚，其他菌群丰度指标均存在发表偏倚。

图1 羊肠道优势门和属丰度的偏倚评估

3 讨 论

因饲料、环境、测序等因素影响，对羊肠道的优势菌群一直存在争议，在门水平，多项研究表明厚壁菌门和拟杆菌门均为优势门前两位[24-25]，且均落在本研究结果变异范围内，本研究中厚壁菌门和拟杆菌门的丰度信息不存在发表偏倚，说明结果具有良好的代表性，且该两个门的微生物在羊肠道中的丰度非常稳健，不易受其它因素扰动。拟杆菌门属于革兰氏阴性菌，Parnell 等[26]研究发现拟杆菌门的丰度与体脂和体重呈现负相关，拟杆菌门细菌基因组中富含大量碳水化合物活性酶基因[27]，能够利用多种膳食可溶性多糖，覆盖藻类、植物、动物等多种来源的底物，代谢产物以乙酸盐和丙酸盐为主[28-29]。拟杆菌门细菌具有多种产维生素和辅酶的基因[30]，可能在羊肠道微生物消化和营养利用中发挥重要作用。厚壁菌门属革兰氏阳性菌，利用宏基因组研究发现厚壁菌门细菌富含生物合成及膜转运相关基因[31]，丁酸盐产量较高，也能产生多种B 族维生素[32]，幼龄动物摄入固体食物后厚壁菌门细菌丰度逐渐提高[32]，随着年龄增长，肠道厚壁菌门/拟杆菌门比值显著升高[33]，厚壁菌门丰度升高可能与抗炎和改善肠道屏障相关[34]，但研究发现过高的厚壁菌门/拟杆菌门比值与2 型糖尿病或肥胖相关[29,35]，羊断奶后肠道以厚壁菌门类群为主，可能也与年龄增长或机体肠道免疫的建立有关。变形菌门、螺旋体门和放线菌门的优势地位在各项研究中并不稳定，原因一方面与实验中使用的羊只数量有限（3～6只）有关[14,24,36-37]；另一方面，可能与这部分菌的发酵特异性有关，受日粮、环境等因素影响较为强烈。变形菌门是细菌中最大的一门，包含著名的机会病原菌，如大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌等[38]，其丰度升高往往伴随肠道炎症的发生；大多数变形菌门细菌不是致病菌，也可编码大量蛋白质和碳水化合物代谢基因，对于维持肠道的厌氧环境起着重要作用[38]。螺旋体门细菌的功能相对研究较少，Ni 等[39]研究发现，饲喂乳酸杆菌和双歧杆菌制剂能够显著提高螺旋体门细菌的丰度。放线菌门虽然占比较小，但其可能在维持羊肠道稳态方面起着关键作用，尤其是双歧杆菌被广泛用作益生菌制剂[40]。目前为止，人们对不同门水平菌的功能认知还很有限，对于菌间协同或拮抗、细菌与宿主互作等方面均有待深入研究。

拟杆菌属和普氏菌属都属于拟杆菌门，是肠型判定的重要依据，两者产短链脂肪酸的能力差异较大，普氏菌肠型比拟杆菌肠型产丙酸能力高出2～3 倍[41]，这可能与两者碳水化合物降解酶系不同有关[42]。本研究表明，羊断奶后以拟杆菌肠型为主，对拟杆菌属和普氏菌属进行干预可能实现对羊肠道微生物发酵类型的调控。研究发现，拟杆菌属的菌株可促进宿主免疫T 细胞的功能完善[43]，还可参与结肠神经元活动的调节[44]，Yoshida[45]发现拟杆菌属的菌株可以减少肠道微生物脂多糖的产生，有效抑制促炎性免疫反应。而普氏菌可参与宿主免疫调节[46]，与多种炎症性疾病有关[47]，肠普雷沃氏菌的定植可能加剧宿主肠道炎症[48]，对羊肠道拟杆菌/普氏菌稳态的调控对机体免疫及健康养殖也具有重要意义。密螺旋体属的细菌包含致病菌[49]，但密螺旋体属细菌属于动物肠道原著菌，是城市化生活的人肠道中逐渐丢失的特殊类群[50]。密螺旋体属作为羊肠道中的优势菌，其与羊断奶后采食的高碳水型饲料密切相关，这与Zhou 等[51]报道的猪肠道密螺旋体属细菌富含大量多糖降解酶基因的结果相符。瘤胃球菌属菌株最早在牛瘤胃中被发现，具有降解纤维素的能力[52]，瘤胃球菌属也富含多种植物多糖水解酶基因[53-54]，在肠道微生态平衡的调节中发挥重要作用[55]。丁酸弧菌是半纤维素降解优势菌[56]，发酵可产丁酸，淀粉、果胶、木聚糖等多种多糖物质[57]均可作为其底物，其在羊肠道中可能参与降解消化道前端未完全消化的多糖或半纤维素。

本研究经P和I2综合检验显示纳入文献存在有异质性，原因是：①试验羊品种和年龄差异；②日粮差异；③羊生理状态、环境差异。除拟杆菌门和厚壁菌门丰度不存在发表偏倚，其他菌群丰度均存在一定程度的发表偏倚。螺旋体门的偏离值来自于Lin 等[23]在2021 年的报道，对照组使用低精料饲喂湖羊，螺旋体门丰度为27.21%，饲喂高精料后螺旋体门丰度显著下降至6.97%，这可能由日粮精粗比导致。Thingholm 等[58]研究发现，城市化的生活方式使得人肠道中螺旋体门细菌丰度降低。螺旋体门可能是较易受日粮结构影响的菌群，随着相关研究的不断积累，在未来研究中有必要基于日粮不同精补比水平对肠道螺旋体门丰度进行亚组分析，分别评估其水平。密螺旋体属的偏离值原因同螺旋体门，可能随日粮精粗比波动较大，其他菌群的偏倚性可能均与研究样本量的限制等因素相关，未来还需要深入研究加以验证。

羊肠道细菌群落受宿主遗传[9]、自身生理状态[59]、生存环境[60]和日粮结构[5]等因素影响，其中最主要的影响因素是日粮结构[61]，肠道微生物的生长和繁殖归根结底来自于对营养元素的竞争和消耗[62-63]，本研究结果反映了当前饲养模式下，羊肠道优势门和属类别及丰度水平，数据量样本的扩大突破了试验研究中样本量小的限制，基于大样本分析得到羊肠道优势门属类别及合理的丰度参考范围，为羊肠道微生物结构特征研究和肠道菌群微生态调控提供数据参考，为羊肠道菌群的肠型判定提供理论依据，未来使用大样本基础测序数据的重分析细化研究仍有待深入开展。

4 结 论

本研究通过Meta 荟萃分析解析羊大肠肠段的优势菌群及其丰度参考范围，结果显示门水平上，羊肠道细菌优势门依次为厚壁菌门（Firmicutes）56.76%、拟杆菌门（Bacteroidetes）28.64%、螺旋体门（Spirochaetes）2.37%、变形菌门（Proteobacteria）2.06% 和放线菌门（Actinobacteria）0.69%；属水平上，羊肠道细菌优势属依次为拟杆菌属（Bacterodies）4.33%、密螺旋体属（Treponema）2.49%、瘤胃球菌属（Ruminococcus）1.60%、普氏菌属（Prevotella）0.67% 和丁酸弧菌属（Butyrivibrio）0.30%，拟杆菌门细菌富含大量碳水化合物活性酶基因，能产多种维生素和辅酶，在羊肠道中发挥重要作用，普氏菌属和拟杆菌属均属于拟杆菌门，是肠型判定的重要依据，羊肠道以拟杆菌肠型为主。试验结果为羊肠道后端菌群健康调控和科学研究提供了理论依据。