鲜味受体TAS1R1/TAS1R3对从江香猪肌内前体脂肪细胞自噬及脂质代谢的调控研究

徐永健，冯贤辀，蒙利洁，高 艺，杨 艺，龚 婷*

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025）

鲜味受体TAS1R1/TAS1R3（Taste Receptor Family 1 Subunit 1/Taste Receptor Family 1 Subunit 3）是味觉受体第一家族（Taste Receptor Family 1，T1Rs）的2 个成员[1-2]。TAS1R1/TAS1R3除了在舌上表达，还表达于其他非味觉器官中（如胰腺[3]、脂肪[4]、膀胱[5]、脑[6]、乳腺[7]等），暗示味觉受体除感知味觉功能外，还有其他生物学功能。另外，TAS1R1/TAS1R3在脂肪组织和脂肪细胞中也起着重要作用。Masubuchi 等[8]研究表明，T1R3 在小鼠前体脂肪细胞中有表达，且随着成脂分化过程的进行，T1R3 表达随之升高。此外，将小鼠体内T1R1/T1R3 敲除后脂肪含量会减少[9]。在小鼠胰腺β细胞中将T1R1 或T1R3 敲除后，细胞会通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）途径发生自噬[10]。

细胞自噬是真核生物内高度保守的代谢过程，对细胞的生存和维持起着重要作用[11]。Singh 等[12]研究发现，脂质进入自噬体后在溶酶体中被降解为脂肪酸，是自噬调节脂质代谢的主要途径，并将此过程命名为“噬脂”。目前，自噬在脂质代谢方面的研究多集中于啮齿类动物上，在猪上鲜有报道，鲜味受体在脂质代谢过程中的作用也备受关注，但是鲜味受体与自噬和脂质代谢之间的关系尚未明晰。本研究以从江香猪肌内前体脂肪细胞为研究对象，利用RNAi 技术干扰细胞内TAS1R1/TAS1R3表达，利用鲜味剂（L-谷氨酸）激活从江香猪肌内前体脂肪细胞内的鲜味受体TAS1R1/TAS1R3，观察细胞内鲜味受体TAS1R1/TAS1R3的表达被干扰或者激活后，细胞自噬相关因子微管相关蛋白1 轻链3 B（Microtubule Associated Protein 1 Light Chain 3 Beta，MAP1LC3B）和Beclin1 以及脂质代谢相关基因神经肽Y（Neuropeptide Y，NPY）、乙酰辅酶A 羧化酶α（acetyl-CoA Carboxylases Alpha，ACACA）和脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein Lipase，LPL）mRNA 的表达情况，探索鲜味受体与自噬和脂质代谢之间潜在的分子机制，对提高从江香猪肌内脂肪含量及改善其肉品质、进一步挖掘品种特性具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 从江香猪肌内脂肪前体细胞由贵州大学许厚强教授馈赠。澳洲胎牛血清、DMEM-F12、DMEM-F12（不含L-谷氨酸）、OPTI-MEM、胰蛋白酶（含0.25% EDTA）、青霉素链霉素混合液均为美国Gibco 公司产品；L-谷氨酸（G107510）为阿拉丁（上海）公司产品；2×Taq Master Mix、DM2000 Marker 均 为北京康为世纪生物科技有限公司产品；TRIzol、反转录试剂盒、PowerUPTM SYBRTM GREEN Master Mix、转染试剂Lipofectamine®3000 均为美国Thermo Fisher Scientific 公司产品；CCK-8 细胞检测试剂盒为美国Glpbio 公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与处理 将从江香猪肌内脂肪前体细胞接种于含10% 胎牛血清的DMEM-F12 培养基中，在含95% O2、5% CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长达到对数期之后，用胰蛋白酶将细胞消化并离心，得到的细胞沉淀重悬后，接种于6 孔板内，待细胞密度达到90% 以上，依次添加低浓度（2.5 mmol/L）、中浓度（5 mmol/L）、高浓度（10 mmol/L）的L-谷氨酸在含5%O2、95% CO2 的37℃细胞培养箱中分别培养3、6 h 后，提取细胞总 RNA，此时的细胞培养基替换为不含L-谷氨酸的DMEM-F12。待细胞密度达到60%～70%，将在上海吉玛公司构建的TAS1R3shRNA 利用转染试剂转染至细胞内，48 h 后提取细胞总RNA。

1.2.2 细胞转染 将从江香猪肌内脂肪前体细胞接种于6 孔板内，待细胞密度达到70% 左右，使用利用细胞转染试剂盒Lipofectamine®3000 将在上海吉玛基因公司合成的TAS1R3shRNA 以及Control shRNA 分别转染至细胞内，培养48 h 后提取细胞总RNA，TAS1R3shRNA-786 靶序列：GGCAAGTTCTTCGGCTTCTTC。

1.2.3 细胞活力检测 为了确定向细胞添加L-谷氨酸和向细胞转染TAS1R3shRNA 后，细胞活性不受影响，因此采用CCK-8 法检测细胞活性。将细胞接种于96 孔板内，加入100 μL 培养基于细胞培养箱内培养24 h 后，更换含有不同浓度L-谷氨酸（2.5 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L）分别培养3、6 h 或者更换含有TAS1R3shRNA 载体的培养基培养48 h；然后向每个孔内加入10 μL CCK-8 溶液，然后37℃孵育3 h，使用酶标仪在450 nm 处测定OD 值，每组重复6 次。

1.2.4 细胞总 RNA 提取及 cDNA 第1 条链合成 使用TRIzol 法提取细胞总 RNA，提取完成后使用 Nanodrop 2000 检测RNA 的浓度和纯度，OD260/280 界于1.8～2.1、OD260/230大于2.0 的RNA 样品才可用于后续研究。根据反转录试剂盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书进行 cDNA 第1 条链的合成，置于-20℃保存备用。

1.2.5 实时荧光定量PCR 引物标准曲线的建立 将用于实时荧光定量PCR 的引物进行普通PCR 扩增，得到的目的片段与pMD19-T 载体连接，然后转化至DH5α 感受态细胞，经过验证为阳性的重组质粒作为标准曲线的扩增模板。得到的重组质粒以10 倍比稀释后作为模板进行荧光定量PCR 扩增，BIO-RAD CFX96TMReal-Time System 荧光定量 PCR 仪自动计算出相应基因的扩增效率、标准曲线、熔解曲线，相应基因的扩增效率在90%～101%，熔解曲线为单峰，无特应性扩增，表明所设计的引物符合荧光定量PCR 需要。实时荧光定量PCR 引物根据NCBI 数据库公布的基因序列，利用Primer 5.0 进行设计，然后送至北京擎科生物公司进行合成，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.2.6 实时荧光定量PCR 参照Thermo Fisher Scientific公司提供的SYBR Green 荧光染料试剂盒说明书，在BIO-RAD CFX96TMReal-Time System 荧光定量 PCR仪上进行试验。所用的PCR 反应体系为10 μL：5 µL PowerUPTMSYBRTM GREEN Master Mix，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.4 µL，0.3 µL cDNA，3.9 µL ddH2O。反应程序：50℃ 孵育2 min，95℃预变性2 min，95℃变性15 s，相应退火温度退火15 s，72℃延伸1 min（40个循环）。实验以ACTB为内参，对照组为内标进行归一化处理，并采用2-ΔΔCt法计算不同处理组中基因的相对表达量，每个样品重复3 次。

1.3 统计分析 结果均以平均值± 标准误来表示，采用SPSS18.0 进行显著性检验，处理组与对照组均值比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间均值比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果

2.1L-谷氨酸、沉默载体对从江香猪肌内前体脂肪细胞的影响 将从江香猪肌内脂肪前体细胞接种于96 孔板内，待其生长汇合度至90% 以上后，向其分别添加0 mmo/L（对照组）、低浓度（2.5 mmol/L）、中浓度（5 mmol/L）、高浓度（10 mmol/L）的L-谷氨酸分别刺激3 h、6 h 后，细胞增殖并未受到明显影响（图1-A）。向细胞内转染TAS1R3shRNA 载体48 h 后，CCK-8 检测发现转染TAS1R3shRNA 载体并未影响细胞正常增殖（图1-B）。

图1 L-谷氨酸、沉默载体对从江香猪肌内前体脂肪细胞的影响

2.2 转染TAS1R3shRNA 48 h 后从江香猪肌内前体脂肪细胞内TAS1R1/TAS1R3的表达 如图2 所示，与对照组相比，转染组TAS1R3的mRNA 表达水平降低81.73%（P＜0.01），TAS1R1的mRNA 表达水平降低93.62%（P＜0.01），说明此序列可作为后续实验材料。

图2 转染TAS1R3 shRNA 48 h 后从江香猪肌内前体脂肪细胞内TAS1R1/TAS1R3 表达

2.3 细胞内TAS1R1/TAS1R3被沉默后自噬相关基因的表达 从江香猪肌内前体脂肪细胞内TAS1R1/TAS1R3mRNA 表达水平被有效干扰后，mTOR的mRNA 表达水平与对照相比下降了86.61%（P＜0.01），MAP1LC3B和Beclin-1则分别上升了2.22 倍和1.53倍（P＜0.01）（图3）。

图3 细胞内TAS1R1/TAS1R3 沉默后自噬相关基因mRNA 的表达

2.4 细胞内TAS1R1/TAS1R3被沉默后对脂质代谢相关基因表达的影响 当细胞内TAS1R1/TAS1R3被沉默后，脂肪合成相关基因NPYmRNA 的表达较对照组下降了60.02%（P＜0.01），ACACA的mRNA 表达下降了56.76%（P＜0.01），而脂质代谢基因LPL的mRNA表达较对照组上升了1.38 倍（P＜0.01）（图4）。

图4 细胞内TAS1R1/TAS1R3 被沉默后脂质代谢相关基因mRNA 的表达

2.5L-谷氨酸可上调细胞内TAS1R1/TAS1R3的表达由图5 可知，与对照组相比，不同浓度的L-谷氨酸（2.5、5、10 mmol/L）分别刺激从江香猪肌内前体脂肪细胞3 h、6 h 后，细胞内TAS1R1/TAS1R3的mRNA 表达水平升高（P＜0.05）。10 mmol/L 的L-谷氨酸刺激细胞3 h 后，细胞内TAS1R1的mRNA 表达水平与对照组相比上升了12.41 倍，TAS1R3的mRNA 表达水平上升了15.02倍（P＜0.01）。与对照相比。10 mmol/L 的L-谷氨酸刺激细胞6 h 后，细胞内TAS1R1的mRNA 表达水平上升了14.51 倍，TAS1R3的mRNA 表达水平上升了22.68 倍（P＜0.01）。因此，选择10 mmol/L 的L-谷氨酸刺激细胞6 h 为后续实验的时间-剂量组合。

图5 不同浓度L-谷氨酸分别刺激细胞3、6 h 后从江香猪肌内前体脂肪细胞内TAS1R1/TAS1R3 的mRNA 表达

2.6 细胞内TAS1R1/TAS1R3表达增加后自噬相关基因的表达 如图6 所示，10 mmol/L 的L-谷氨酸刺激细胞6 h 后，mTOR的mRNA 表达较对照组上升44.31%（P＜0.05），细胞自噬标志基因MAP1LC3B的mRNA表达下降80.93%（P＜0.01），细胞自噬相关基因Beclin-1下降了69.23%（P＜0.01）。

图6 细胞内TAS1R1/TAS1R3 激活后自噬相关基因mRNA 的表达

2.7 细胞内TAS1R1/TAS1R3表达增加后对脂质代谢相关基因表达的影响 在利用10 mmol/L 的L-谷氨酸刺激从江香猪肌内前体脂肪细胞6 h 后，细胞内TAS1R1/TAS1R3被激活，对脂质代谢相关的基因进行mRNA表达水平上的检测，结果如图7 所示，脂肪合成相关基因NPYmRNA 的表达水平较对照组提高72.21%（P＜0.05），ACACA的mRNA 表达水平上升了1.53倍（P＜0.05），而脂质代谢基因LPL的mRNA 表达水平则下降了76.29%（P＜0.01）。

图7 细胞内TAS1R1/TAS1R3 激活后脂质代谢相关基因mRNA 的表达

3 讨 论

本研究利用 RNAi 技术干扰从江香猪肌内前体脂肪细胞内TAS1R1/TAS1R3的表达，经过 qRT-PCR 检测得到细胞内TAS1R1/TAS1R3的mRNA 表达水平均被抑制了80%以上，说明TAS1R1/TAS1R3抑制模型建立成功；利用L-谷氨酸成功建立了从江香猪肌内前体脂肪细胞鲜味受体TAS1R1/TAS1R3激活模型，且TAS1R1/TAS1R3mRNA 表达呈剂量依赖模式，10 mmol/LL-谷氨酸培养 6 h 是激活从江香猪肌内前体脂肪细胞鲜味受体TAS1R1/TAS1R3表达的最佳条件。

细胞自噬依赖溶酶体途径对细胞内的细胞质蛋白和细胞器进行降解，降解过程中产生的氨基酸、脂肪酸可供细胞重新利用。在营养缺乏的条件下，动物机体会将存储在脂肪组织中的甘油三酯水解为游离脂肪酸，后者随血液运送至机体各部位为机体供能[13]。自噬与脂质代谢过程都涉及到脂肪酸供能的环节，两者是否存在关联尚待研究。近年来，研究发现，脂肪细胞中的自噬和脂质代谢相互关联，它们共同调节脂肪细胞中的物质平衡和内环境稳态[14]。作为经典信号通路激活脂肪组织的胞质内脂肪酶β肾上腺素受体被激活以后，会促进自噬体与溶酶体的融合，促进细胞发生自噬，同时会开启脂肪细胞内脂质水解的进程[15-16]；有研究显示姜黄素能显著抑制猪脂肪细胞脂质沉积并促进细胞发生自噬[17]。mTOR 是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其参与脂肪生成和自噬等生理过程[18-19]。mTOR 作为营养、能量、生长因子等信号的感受器，被认为是自噬调控中一个重要节点，mTOR 活性下调时会诱导细胞发生自噬，而mTOR 被激活后会抑制自噬复合物的生成，抑制细胞自噬发生[20]。在自噬发生的过程中，MAP1LC3B一直存在于自噬体和自噬溶酶体上，被认为是经典的自噬标志蛋白[21]。Beclin 1被认为是哺乳动物体内调节自噬的一个重要核心基因，是形成自噬体的关键成分之一[22]。在本研究建立的TAS1R1/TAS1R3激活模型中，mTOR的mRNA 表达升高，MAP1LC3B和Beclin 1的mRNA 表达显著降低，说明细胞自噬被抑制，而在干扰模型中，MAP1LC3B和Beclin 1的mRNA 表达显著升高，细胞发生自噬。本研究结果进一步证明了Wauson等提出的T1R1/T1R3 可通过调控mTORC1 来介导细胞自噬[10]。胰岛素刺激的mTOR 信号通路激活了脂肪酸生物合成的下游酶表达，促进脂肪生成[23]。NPY 作为食欲刺激因子，在与其受体结合以后在脂质代谢中起到重要的调节作用[24]，NPY 还可促进腹壁血管生成和白色脂肪的增殖分化，最终导致肥胖的发生[25]。ACACA 是脂肪酸从头合成的关键限速酶，参与脂肪合成过程[26]。LPL 能分解脂蛋白中的三酰甘油，将小鼠中的LPL 敲除之后，其内脏脂肪含量明显上升[27]。简言之，当机体内脂肪含量上升时，NPY、ACACA 表达上升，LPL则下降。在本研究建立的TAS1R1/TAS1R3抑制模型中，脂质代谢相关基因的表达模式表明，当TAS1R1/TAS1R3被抑制后，mTOR的mRNA 表达水平极显著降低，脂质代谢关键基因NPY、ACACA的mRNA 表达水平也极显著下降，LPL的mRNA 表达水平则极显著升高，说明脂肪合成能力降低，这符合之前提出的小鼠中T1R3基因缺失会导致脂肪减少的结果[28]。本研究中，细胞内TAS1R1/TAS1R3激活模型中mTOR的mRNA 表达水平显著升高，脂质代谢关键基因NPY、ACACA的mRNA 表达水平也极显著升高，LPL的mRNA 表达水平则极显著下降。这表明当从江香猪肌内前体脂肪细胞内的TAS1R1/TAS1R3被激活之后，脂肪合成的能力增加，这与Choo 等[29]在小鼠饮食中添加甜味剂使得甜味受体T1R2/T1R3 表达显著增加以及脂肪含量增加的结果相符。本研究结果表明，从江香猪肌内前体脂肪细胞中的鲜味受体TAS1R1/TAS1R3被抑制后，细胞发生自噬，同时抑制了细胞脂肪合成的能力，而当细胞内鲜味受体TAS1R1/TAS1R3被激活以后，细胞自噬活性降低，细胞脂肪合成能力提高，这在一定程度上说明鲜味受体TAS1R1/TAS1R3影响机体的脂质代谢或与细胞自噬有关。

自噬作为一种存在于真核生物内、作用于维持细胞稳态、维护细胞生长的信号通路，与人类的疾病与健康息息相关。随着“噬脂”这一概念提出，加上近年来自噬领域飞速发展，脂肪组织中的自噬与脂质代谢及脂肪细胞分化领域的研究不断拓展，但这方面的研究多集中在小鼠、大鼠等动物上，在畜禽领域的研究较为缺乏。最近在小鼠和人上的研究都表明体重增加都受到味觉受体的影响[30-31]，但这些研究多集中于甜味受体。本研究首次将目光聚焦在鲜味受体TAS1R1/TAS1R3介导细胞自噬以及影响影响脂质代谢上，从分子机制上探讨其中的关系，可为理解自噬与脂质代谢之间的关系提供新的方向，也可为继续挖掘味觉受体的非味觉功能提供数据。本次研究结果还可为在畜禽日粮添加剂上的使用提供基础数据，为增加从江香猪肌内脂肪含量提供参考，从而为更好地开发利用其品种优势打下基础。

4 结 论

本实验结果显示，从江香猪肌内前体脂肪细胞中鲜味受体TAS1R1/TAS1R3被抑制后，细胞自噬关键基因MAP1LC3B、Beclin 1的 mRNA 表达水平极显著升高，脂质代谢相关基因NPY、ACACA的 mRNA 表达水平极显著下降，LPL的 mRNA 水平极显著升高，表明鲜味受体被抑制后会介导细胞发生自噬，细胞脂肪合成的能力同时也被抑制；而当细胞内鲜味受体TAS1R1/TAS1R3被激活后，细胞自噬关键基因MAP1LC3B、Beclin 1的 mRNA 表达水平极显著降低，脂质代谢相关基因NPY、ACACA的 mRNA 表达水平极显著上升，LPLmRNA 表达水平极显著降低，这说明细胞发生自噬的能力被抑制，增强了细胞脂肪合成的能力。