黔北麻羊PPP3CA基因克隆、生物信息学分析及不同组织表达研究

惠茂茂，陈 祥*，敖 叶，周志楠

（1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州贵阳 550025；2.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025）

黔北麻羊作为贵州省三大山羊品种之一，其在生态学特征、体质外貌特征、生理指标、生产性能、繁殖性能等方面均具有诸多特点[1]，尤其在肉质优良特性方面具有较高的开发价值[2]。羊肉肉质细嫩、营养丰富，深受消费者喜爱[3]。羊骨骼肌是主要食用部分，占机体干重的40%～50%[4]。肌纤维是构成动物骨骼肌组织的基本单元，是肌肉生长的重要参数。钙调磷酸酶是影响肌纤维的重要信号分子。蛋白磷酸酶3（Protein Phosphatase 3，PPP3）又称钙调磷酸酶（Calcineurin，CaN）是受Ca2+/ 钙调素（Calmodulin，CaM）调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，由1 个催化亚单位（PPP3 Catalytic Subunit，PPP3C）和1 个调节亚单位（PPP3 Regulatory Subunit，PPP3R）组成的异源二聚体[5-6]。在脊椎动物中PPP3C有PPP3CA、PPP3CB和PPP3CC3 个亚单位，其中PPP3CA 和PPP3CB 在机体内分布广泛[7-9]，PPP3CA在脑和心血管系统中分布最多。在骨骼肌中，PPP3参与成肌细胞分化、成熟肌纤维肥大和响应细胞内钙浓度变化的纤维类型转换的调节。有研究表明，PPP3CA基因是小鼠几乎所有类型骨骼肌的主要催化亚型[10]。此外，PPP3CA基因在天府山羊的股二头肌、长肌和腹肌中也具有较高水平的表达[11]。迄今为止PPP3CA基因已在人[12]、小鼠[13]、猪[14]和牛[15]等多种动物中克隆并发现其编码的蛋白高度保守，关于黔北麻羊的报道较少。因此，本实验以黔北麻羊为研究对象，以PPP3CA为候选基因，克隆获得黔北麻羊PPP3CA基因编码序列进行生物信息学分析，运用实时荧光定量PCR 建立黔北麻羊PPP3CA基因的组织表达图谱，为研究PPP3CA基因的生物信息学功能机理提供参考作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取贵州省习水县富兴畜牧业开发有限公司提供的6 只健康成年黔北麻羊母羊，羊只屠宰方法参考贵州省地方标准《羊屠宰操作规程》（DB 22/T 2740-2017），分别采集心、肝、脾、肺、肾、背最长肌6 个组织，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 实验试剂及仪器 快速琼脂糖凝胶回收试剂盒、T-克隆PCR 产物克隆试剂盒为上海生工生物工程技术有限公司产品；TRIzol＠Reagent 试剂盒为贵州绿盟英创生物科技有限公司产品；荧光定量试剂q-PCR Mix 为北京擎科生物科技有限公司产品；逆转录试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品。电泳仪（DYY-2C型）为北京市六一仪器厂产品；PCR 扩增仪（C1000 TouchTM）、实时荧光定量PCR 仪（型号为CFX96 Real-Time System）、凝胶成像系统（Universal Hood Ⅱ）均为美国BIO-RAD 有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计 根据GenBank 公布的山羊PPP3CA基因序列（登录号：XM_018049270.1）；利用Primer Premier 5.0 软件进行克隆、荧光定量引物设计，以β-actin 为内参[16]。设计后引物交上海生工生物工程技术服务股份有限公司合成。引物基本信息见表1。

表1 黔北麻羊PPP3CA 引物信息

1.3.2 RNA 提取与反转录 按照Trizol 法提取组织总RNA，分光光度计测定其浓度及OD 值（OD260/OD280），Hi Fi-Saript 逆转录试剂盒合成首链cDNA，将产物置于-20℃冰箱保存。

1.3.3 荧光定量PCR 检测PPP3CA基因的组织表达谱 采用荧光定量PCR 检测PPP3CA基因在不同组织中的表达情况。扩增体系为10 μL：2×UltraSYBR Mixture 5 μL，Forward Primer 0.5 μL，Reverse Primer 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。qRT-PCR 程序：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 个循环；60℃每5 s 增加0.5℃扩增至95℃进行熔解曲线收集，使用SPSS 23.0 软件进行差异显著性检验。

1.3.4PPP3CA基因CDS 区的扩增 PCR 反应体系20 μL：2×Es Taq Master Mix 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/μL）各1.5 μL，RNase-Free Water 5.5 μL，cDNA 模 板2.0 μL（1 500 ng/μL）。PCR 反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸1 min，35 个循环；72℃终延伸5 min；1.0%琼脂糖凝胶电泳检测产物。

1.3.5PPP3CA基因的克隆 PCR 产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳后回收纯化目的条带，取适量纯化回收的目的DNA 片段与pMD19-T 克隆载体连接，恒温水浴16℃连接16 h 并转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，挑取白色阳性单克隆菌落至LB（Amp+）液体培养基中扩大培养（37℃），最后进行菌液PCR 鉴定并送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序[17]。

1.3.6PPP3CA基因的生物信息学分析 使用Prot Param（http://expasy.org/tools/protparam.h tml）分析StAR 蛋白理化性质；使用NPS＠SOPMA 软件在线分析蛋白质二级结构；使用S WISS-mode（https://swissmodel.expasy.org/）软件分析、预测StAR 蛋白质三级结构；使用ProtScale(http:www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl/）分析亲疏水性；使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件进行跨膜区分析；使用PSORT II Preadict（https://psort.hgc.jp/form2.html）进行亚细胞定位；使用DNASTAR 7.1 软件中的MegAlign程序进行物种同源性分析和系统进化树构建[18]。

2 结果与分析

2.1PPP3CA基因克隆引物结果及PCR 扩增结果 如图1 所示，实时荧光定量扩增出约为125 bp 的条带，CDS区克隆引物扩增出1 566 bp 的条带，引物特异性符合实验要求。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物

2.2PPP3CA基因在黔北麻羊组织表达量分析 由图2可知，PPP3CA基因在黔北麻羊不同组织中均有不同程度的表达；其中在背最长肌表达量最高，脾脏表达量最低，且两者之间差异极显著；背最长肌组织表达量极显著高于其他组织；肺组织表达量极显著高于心、肝、脾和肾组织；心、肝、脾和肾之间的组织表达量互不显著。

图2 PPP3CA 基因在黔北麻羊组织中表达图谱

2.3 黔北麻羊PPP3CA基因T 克隆载体的鉴定PPP3CA基因菌液PCR 验证结果如图3 所示，菌液PCR 条带位置与目的条带位置一致，CDS 区片段大小为1 566 bp，可进行下一步实验。图4 显示黔北麻羊PPP3CA基因与NCBI 公布的山羊PPP3CA基因序列吻合度达到100%，无碱基、氨基酸的突变。菌液PCR 与测序验证证明目的基因pMD19-T-PPP3CA 克隆载体构建成功。

图3 PPP3CA 基因菌液PCR 检测

图4 黔北麻羊PPP3CA 部分克隆与NCBI 上传序列对比结果

2.4 黔北麻羊PPP3CA基因生物信息学分析

2.4.1 理化性质分析 经ExPASy 在线程序分析可知，黔北麻羊PPP3CA基因的分子式为C2611H4071N703O783S26，分子量约58.67 ku，原子总数8 194，含有521 个氨基酸，且丙氨酸Leu（L）所占比例最高，为10.0%，色氨酸Trp（W）占比最低，为0.8%。带负电荷的残基总数（Asp+Glu）为69 个，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）为57 个，说明该序列带正电荷。理论等电点PI 为5.58；该蛋白不稳定指数达48.02，归为不稳定蛋白。

2.4.2 疏水性分析 经ProtScale 程序分析黔北麻羊PPP3CA 蛋白的疏水性分析图谱如图5 所示，0 为分界点，正值表示疏水性数值，负值表示亲水性数值，第368 位缬氨酸疏水性最强，分值为1.989，第484 位脯氨酸亲水性最强，分值为-2.811，说明该蛋白为亲水性蛋白质。

图5 PPP3CA 蛋白质疏水性图谱

2.4.3 蛋白质二级结构预测分析 经SOPMA 软件分析黔北麻羊PPP3CA 蛋白质二级结构如图6 所示，蛋白质结构有4 种结构组成，占比最大的是α-螺旋，为45.68%，其次为无规则卷曲，占比为37.04%，延伸链占比为12.67%，β-折叠占比最小，为4.61%，可知此蛋白二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。

图6 PPP3CA 蛋白质二级结构分析

2.4.4 蛋白质三级结构预测分析 经SWISS-MODEL 在线分析结果如图7 所示，黔北麻羊PPP3CA 蛋白质结构中α-螺旋和无规则卷曲占据大部分，与其二级结构分析结果相符。

图7 PPP3CA 蛋白质三级结构分析与预测

2.4.5 跨膜区分析 使用TMHMM 在线工具对黔北麻羊PPP3CA 进行跨膜区分析，结果如图8 所示，此蛋白属于非跨膜蛋白。

图8 PPP3CA 蛋白的跨膜分析结果

2.4.6 PPP3CA 蛋白质亚细胞定位 使用TargetP 在线软件对黔北麻羊PPP3CA基因进行亚细胞定位，结果显示黔北麻羊PPP3CA 蛋白56.5% 可能定位在细胞质中，有56.5%的可能定位在线粒体中，17.4%可能定位在细胞核，液泡和分泌系统的小泡可能性均为4.3%。

2.4.7 PPP3CA 同源性分析及系统进化树分析 使用DNA star 软件中的MegAlign 对黔北麻羊PPP3CA 氨基酸编码序列与人类、绵羊、蝙蝠、鸡、大鼠、鲨鱼、猩猩、犀牛、海豚、狗10 个物种进行同源性以及MEGA6 系统进化树结果分析，结果如图9 和图10 所示。由图9所知，黔北麻羊PPP3CA 氨基酸序列与人类、绵羊、蝙蝠、鸡、大鼠、鲨鱼、猩猩、犀牛、海豚、狗的相似性分别达到99.6%、100%、99.4%、98.3%、99.6%、91.5%、99.6%、99.4%、99.4%、99.6%，数据表明黔北麻羊PPP3CA 氨基酸序列与这些物种之间相似性很高，其中与绵羊的同源性最高达到100%。由图10 可知，系统进化树也证明了黔北麻羊与不同物种间的亲缘关系，与同源性分析的结果相符合。

图9 黔北麻羊PPP3CA 同源性分析

图10 黔北麻羊PPP3CA 系统进化树

3 讨 论

钙调神经磷酸酶通过NFAT（活化T 细胞核因子）调节基因表达，NFAT 通常位于细胞质中，但是在去磷酸化时会转移到细胞核中。NFAT 核易位后，与基因启动子结合并调节下游靶基因的表达。因此，钙调神经磷酸酶对增加的细胞内Ca2+水平作出反应，以翻译该信号以通过NFAT 进行转录调节[19]。该途径在许多器官系统的发育和功能中发挥作用，包括免疫系统、神经系统、心血管系统、肌肉骨骼系统和泌尿系统[20]。Myers 等[21]研究发现，在癫痫和神经发育疾病中，PPP3CA基因编码一种涉及突触小泡循环的蛋白质，进一步强化了在癫痫中突触小泡周期失调的作用。除上述研究外，更多研究是关于PPP3CA参与骨骼肌生长变化，而关于黔北麻羊PPP3CA基因的调节机制研究甚少。本研究以黔北麻羊组织样cDNA 为模板扩增的CDS 区与NCBI 上山羊的氨基酸序列进行对比，没有发现突变位点以及氨基酸的改变，说明序列扩增成功。同时，通过软件分析证明黔北麻羊PPP3CA 编码蛋白属于亲水性、非跨膜蛋白，并且通过核苷酸序列比对发现黔北麻羊PPP3CA与其他物种都有较高的同源性，说明PPP3CA是从同一个祖先进化来的。黔北麻羊PPP3CA与绵羊的同源性最近，亲缘关系最近，达到100%，与鲨鱼的同源性关系较远，说明黔北麻羊PPP3CA基因符合生物进化进程。使用软件分析黔北麻羊PPP3CA 蛋白质三级结构与Wan 等[11]在天府山羊对PPP3CA 分析的结果一致。

同时本实验发现，PPP3CA基因在黔北麻羊心、肝、脾、肺、肾、背最6 个组织中有不同程度的表达差异，在背最长肌中表达量最高，在脾中表达量最低。单艳菊等[22]研究了PPP3CA基因在不同品种鸭发育早期肌肉中的表达，发现此基因分别在高邮鸭和金顶鸭的胸肌、腿肌中普遍表达水平较高，且在13 胚龄表达量达到最高峰。包艳波[23]研究发现，PPP3CA基因突变会不同程度影响大骨鸡公母鸡的肉质性状，尤其在胸肌灰分含量、胸腿肌pH 等方面影响较明显。彭兴等[24]研究发现，PPP3CA基因的3 非编码区（3 UTR）具有与miR-21结合的潜在靶位点，猪miR-21 能靶向调节PPP3CA基因参与骨骼肌的生长发育。本实验也显示，PPP3CA在山羊不同组织表达且在背最长肌（肌肉组织）的表达量最高，与上述结果[22-24]一致，提示PPP3CA基因也是山羊肌肉纤维生长发育的重要基因，但关于PPP3CA基因对山羊肌肉生长的调控机制还需进一步研究。