霍山石斛通过上调突触蛋白Arc表达增强衰老小鼠学习记忆的研究

王龙海,吴 鹏,王国权,方正清

(安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012)

石斛属于多年生草本植物，是中国常用的名贵中药材。中国有记载的石斛有83种，其中近40种为药用石斛。石斛的功效以益胃生津、滋阴清热为主，但近年来研究发现，石斛具有延缓衰老、调节免疫、缓解糖尿病及其并发症、抑制肿瘤、抗氧化等方面的药理作用。霍山石斛是安徽省道地药材，是石斛的上品，2020年被正式载入《中华人民共和国药典》，其功效研究有待进一步加强。上述石斛功效的研究基本上围绕石斛的主要成分展开，且其延缓衰老的机制也未被完全阐明，罕有对石斛全药的研究，而临床上用石斛防治衰老时大多采用其全药。因此，探讨石斛全药延缓衰老的作用及机制具有重要意义。本研究拟构建C57BL/6小鼠衰老模型，从小鼠学习记忆能力、海马超微结构和活动调节性细胞骨架相关蛋白(activity-regulatedcytoskeleton-associated protein，Arc)表达方面探讨霍山石斛延缓衰老的作用及其机制。

1 材料

1.1 动物 雌性SPF级C57BL/6小鼠，8周龄，由北京唯尚立拓科技有限公司[生产许可证号：SCXK(京)2016-0009]提供。每笼3～5只群养，喂养环境的明暗周期为12 h(7:00 开灯，19:00关灯)，室温(22±2)℃，湿度(55±10)%。

1.2 药材 霍山石斛购自安徽安中大道地中药材开发有限责任公司，经安徽中医药大学刘劲松教授鉴定为正品。参照文献[4]的方法将石斛打粉，过100目筛，用蒸馏水配制成质量浓度为0.14 g/mL的混悬液，置4 ℃冰箱待用。给药前加热至室温，搅拌均匀。

2 方法

2.1 给药方法 参考文献[5-6]的方法确定C57BL/6小鼠早期和晚期给药时间。早期给药组：52周龄，12周龄开始给药40周；晚期给药组：52周龄，40周龄开始连续给药12周。按照文献[4]的方法，每日按0.7 g/kg剂量给予霍山石斛混悬液灌胃。模型组：52周龄，12周龄开始给予等容积蒸馏水灌胃40周；对照组：12周龄，每组均为11只。实验开始前1周，将小鼠移至检测室适应性饲养，实验者每天接触1次(拎尾、抚摸)。整个实验期间，动物可得到足够的食物和水，行为学实验在9:00-15:00由专人完成，实验过程中均严格遵循实验动物的伦理学要求。

2.2 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫是检测C57BL/6小鼠学习记忆能力的较好系统。本研究实验过程包括5 d的隐藏平台定位航行实验和1 d的撤台空间探索实验。每天实验前，以脱脂奶粉800 g将水迷宫的水调为白色，水下平台白布包裹。小鼠正式实验前2 d进行适应性训练，让小鼠自由游泳60 s，使其熟悉水池环境及实验员的抓取等操作。隐藏平台实验第1天，先引导小鼠站立于平台上15 s，使小鼠熟悉和记忆平台位置，然后在1、2、3、4象限，让小鼠面向水池壁入水，记录小鼠在60 s内寻找隐藏平台所游泳的总路程。第1天至第5天为隐藏平台定位航行实验，第6天开始撤台空间探索实验。每只小鼠测试时间均为60 s，记录小鼠在靶象限(隐藏平台)游泳时间。游泳路程指标能更好地反映中老年小鼠学习期的学习能力，故本研究使用平均游泳路程作为学习能力指标，用靶象限内的游泳时间作为记忆能力指标。

2.3 透射电子显微镜观察小鼠海马CA3区超微结构 行为学测试1周后，每组随机取3只小鼠，采用10%水合氯醛腹腔麻醉，固定四肢，开胸腹暴露心和肝，灌注针插至左心室，同时剪开右心耳，快速灌注生理盐水冲洗至肝脏变白，继而改用4%多聚甲醛灌注至小鼠肢体僵直，在冰上的平皿中断头取脑，经视交叉中线的正中矢状切面切开脑。迅速取右侧脑海马CA3区脑组织块，常规制备电子显微镜超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅分别染色，采用HITACHI HT-7800透射电子显微镜对海马CA3区超微结构进行观察、摄片和分析。

2.4 免疫印迹法检测海马CA3区Arc蛋白表达水平 取每组剩余的8只小鼠，采用10%水合氯醛腹腔麻醉，断头处死，在冰上快速取脑，用预冷的PBS冲洗数次，沿正中矢状面切开小鼠脑。取右侧海马CA3区脑组织，按文献[9]的方法进行免疫印迹检测。使用BCA法对标本总蛋白进行定量分析，通过10% SDS-PAGE 电泳分离总蛋白，经转膜和封闭等流程后，再分别加入抗Arc单克隆抗体(Abcam，1∶1 000稀释)和抗GAPDH内参抗体(鼠单抗，Solarbio M1000110，1∶3 000稀释)，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，再加入相应的二抗(羊抗兔IgG-HRP，Solarbio SE134，1∶5 000)，此后加入ECL显影剂，应用FCM凝胶成像系统进行曝光、拍照以及数据处理。以目的蛋白(Arc)与内参蛋白(抗GAPDH)灰度值的相对比值作为Arc蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

3 结果

3.1 霍山石斛对C57BL/6小鼠水迷宫试验游泳路程和靶象限游泳时间的影响 随着实验时间的延长，各组小鼠的游泳路程逐渐缩短。与对照组比较，模型组小鼠第2天至第5天游泳路程显著增加(

P

<0

.

05)；与模型组比较，早期给药组第2天至第5天游泳路程显著缩短(

P

<0

.

05)，晚期给药组小鼠仅第2天和第4天游泳路程显著缩短(

P

<0

.

05)。与对照组比较，模型组小鼠在靶象限游泳时间明显减小(

P

<0

.

05)；与模型组比较，早期给药组小鼠在靶象限游泳时间明显增加(

P

<0

.

05)；晚期给药组小鼠在靶象限游泳时间与模型组比较，差异无统计学意义(

P

>0

.

05)。见表1。

表1 霍山石斛对小鼠水迷宫试验游泳路程和靶象限游泳时间的影响

3.2 霍山石斛对C57BL/6小鼠海马CA3区超微结构的影响 透射电子显微镜下早期给药组和对照组小鼠海马的超微结构相似，海马CA3区可见较多结构清晰的线粒体，线粒体嵴排列较整齐，突触结构较清晰且较多；模型组和晚期给药组小鼠较多出现线粒体空泡化和嵴断裂或扭曲，线粒体数量和突触数量减少，突触后膜较致密。见图1。

注： A.对照组；B.模型组；C.早期给药组；D.晚期给药组

3.3 霍山石斛对C57BL/6小鼠海马突触蛋白Arc表达水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠海马CA3区Arc表达水平显著降低(

P

<0

.

05)；与模型组比较，仅早期给药组小鼠海马CA3区Arc表达水平显著升高(

P

<0

.

05)。见图2、表2。

注：A.对照组；B.模型组；C.早期给药组；D.晚期给药组

表2 各组小鼠海马CA3区Arc相对表达水平比较

4 讨论

学习记忆功能减退是阿尔茨海默病等脑衰老疾病的主要临床表现。本研究中，早期给药组从C57BL/6小鼠海马发育成熟的12周龄开始给药，晚期给药组从40周龄衰老后开始给药，按照文献[4]的剂量给药至52周龄，检测结果提示，霍山石斛早期给药可以预防学习记忆功能减退，但衰老后给药对学习记忆能力改善不显著。这与姜琳珊发现的金钗石斛总生物碱能明显改善小鼠的学习记忆能力，但衰老后给药不能改善老年小鼠学习记忆功能结果相一致。本研究结果提示，霍山石斛对学习记忆功能衰退的预防作用较确切，而衰老后的治疗作用有待进一步研究。

海马是与年龄相关性学习记忆功能减退关系密切的脑区。姚建平等证实衰老大鼠海马齿状回神经细胞超微结构发生变化，神经细胞的线粒体明显减少。李可等研究发现，老龄小鼠海马线粒体长度缩短，线粒体嵴扭曲，认为超微结构受损，从而影响线粒体功能，进而引起海马内ATP水平降低。高立伟等认为，线粒体受损等变化与小鼠空间学习和记忆评分的减少相关。本研究发现，衰老C57BL/6小鼠海马CA3区超微结构与姚建平、李可等的报道相似，并发现早期给予霍山石斛，线粒体和突触的数量和形态结构均有影响，可改善海马神经细胞超微结构。阿尔茨海默病、血管性痴呆等神经退行性疾病可出现线粒体异常。结合行为学实验结果，笔者认为霍山石斛可能通过调节小鼠海马线粒体和突触影响学习记忆能力。

Arc是一种在树突和核室之间穿梭的突触后蛋白质，对突触可塑性和突触消除至关重要，Arc控制AMPA受体的运输，从而调节突触可塑性，以及空间记忆巩固。本实验提示对照组和早期给药组C57BL/6小鼠海马CA3区Arc表达水平显著高于模型组，提示早期长期给予霍山石斛对Arc的表达和代谢具有影响，这一结果与Zhang等的研究相似。Arc常定位在树突突起的底部，当突触活动增强时，Arc表达显著增加。神经细胞的能量需求几乎完全依赖于线粒体，并且线粒体也具有协调突触中神经递质的释放等功能，可见Arc的表达与线粒体相关。

本研究提示，早期给予霍山石斛可以延缓或预防小鼠学习记忆能力减退，其机制可能与上调突触蛋白Arc的表达水平，进而影响海马突触结构有关。