TGF-β1在肝纤维化发生发展中作用及机制的研究进展

陈阳，任思思，范妤，郭东艳，李京涛，史晓燕，段丽芳

1 陕西中医药大学基础医学院，陕西咸阳 712046；2 陕西省中药基础与新药研究重点实验室；3 陕西中医药大学第一附属医院肝病科

肝纤维化是各种肝病必经的病理过程，病毒性肝炎、酗酒、代谢性疾病、自身免疫性疾病和胆汁淤积性肝病等引起的肝脏持续性损害都可诱发肝纤维化的发生发展。有研究显示，肝纤维化是诱发肝硬化甚至肝细胞癌的主要原因，约90% 的肝细胞癌是在肝纤维化或肝硬化的基础上发展而来。近年来有报道认为，逆转肝纤维化有助于防止病情向肝硬化、肝癌恶化，而转化生长因子-β1（TGF-β1）是迄今为止发现的最有效的促纤维化细胞因子，且被认为是肝、肺和肾脏纤维化反应的主要中介因子，因此调控TGF-β1 的表达对肝纤维化的发生发展具有重要意义。现就TGF-β1 在肝纤维化发生发展中机制的研究进展进行综述。

1 TGF-β1概述

TGF-β 家族由TGF-βs、活化素、抑制素、骨形态发生蛋白（BMP）等33个成员组成。其中TGF-βs 主要分为TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3 三种类型。这三种类型在细胞内均合成为含潜伏期相关肽和成熟结构域的前体前肽，合成的前体前肽不仅被分泌到细胞外基质（ECM）中，而且被储存在一个无需新合成且能快速可用的TGF-β 池中［1］。当机体受到相关作用时，前体前肽形式的TGF-β被切割，通过与靶细胞表面的特异性激酶受体结合形成信号激活其TGF-β的生物活性［2］。其中，TGF-βs中的TGF-β1具有调节细胞增殖、分化、伤口愈合等分子功能，并在肝纤维化发生发展的过程中发挥重要作用。

2 TGF-β1 通过参与ECM 的生成和降解促进肝纤维化发生发展

ECM 主要来源于骨髓源性纤维细胞、门脉成纤维细胞、激活的肝星状细胞（HSCs）、发生上皮间质转化（EMT）的肝细胞和发生EMT 的胆管细胞。正常肝脏中的ECM 处于生成和降解的平衡状态。当发生慢性肝损伤时，肝脏发生过度愈合使ECM 沉积过多而导致纤维瘢痕增生最终发生肝纤维化。通常，ECM 在肝体积中占比约10%，其主要组成成分有包埋其他基质成分的糖胺多糖、细胞外基质蛋白聚糖，增加ECM 强度和韧性的胶原和弹性蛋白，使细胞与基质结合的纤维连接蛋白、纤粘蛋白等［3］。研究显示，在调节ECM 组成方面，TGF-β1 可通过上调纤维连接蛋白、胶原蛋白、整合素和基底膜蛋白（如层黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白和巢蛋白）的表达使ECM 增多；在调节ECM 功能方面，TGF-β1 可在促进伤口愈合反应中诱导ECM 中含量较少的肌腱蛋白表达，该蛋白在正常肝组织中几乎不表达，但在纤维化肝组织内可促进细胞的迁移和增殖［4］。

3 TGF-β1 通过参与多种细胞间的相互作用促进肝纤维化发生发展

3.1 肝内多种细胞分泌产生TGF-β1 研究发现，TGF-β1在肝脏的生理和病理过程中均发挥作用，它参与了肝脏损伤、炎症、肝纤维化、肝硬化及肝癌进展的全过程。在肝脏中，肝细胞、HSCs、肌成纤维细胞、枯否细胞、肝窦内皮细胞和血小板等均可分泌TGF-β1［5-6］。分泌的TGF-β1 储存在TGF-β 池中，当肝脏受到损伤时，TGF-β 池前体前肽形式的TGF-β1被激活并促进肝纤维化的产生。由于肝细胞是肝脏内数量最多的实质细胞，当肝脏遭受持续性慢性损伤时，在肝纤维化初期，TGF-β1 主要来源于受损的肝细胞；在肝纤维化进展期，TGF-β1 主要来源于HSCs，其次是枯否细胞；在肝纤维化阶段后期或肝硬化期，TGF-β1主要来源于缺氧肝细胞［7-8］。

3.2 TGF-β1通过肝内多种细胞间的相互作用促进肝纤维化 在肝纤维化初期的发展中，TGF-β1和其他生长因子如表皮细胞生长因子首先将肝窦腔中的HSCs 扩散开来，TGF-β1 刺激HSCs 进一步迁移到ECM 累积的肝损伤区域，使肝纤维化进程持续［4，8］。在肝纤维化初期到发生发展阶段，由损伤的肝细胞分泌的TGF-β1 可激活HSCs 并促进HSCs 向肌成纤维细胞方向转化［8］，由肝血窦内皮细胞、激活的血小板分泌的TGF-β1 可促进HSCs 活化、增殖并合成分泌胶原［9］。研究发现，活化的HSCs 能够分泌大量的ECM、基质金属蛋白酶（MMPs）、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）、血小板衍生因子（PDGF）等，共同参与促进ECM 的生成和降解失衡，同时HSCs 还可分泌TGF-β1 以自分泌形式作用于HSCs、以旁分泌形式作用于其他细胞受体如肝细胞，进一步增强HSCs的增殖、迁移和转化能力，促进肝纤维化的发生发展［5，9-10］。此外，活化状态下的TGF-β1也能促进肝细胞和胆管细胞发生EMT，促进其向肌成纤维细胞方向转化而导致ECM 过度累积［10］。在肝纤维化发展过程中，枯否细胞在肝血窦腔变为游走的巨噬细胞，与血液中单核分化而来的巨噬细胞一起共同在纤维化进展中发挥双边作用。这两种来源的巨噬细胞一方面通过分泌促纤维化炎性因子如TGF-β1、IL-1β、肿瘤坏死因子-α 提高活化的HSCs 的存活率，通过分泌CC 趋化因子-2（CCL2）和CCL7 促进HSCs 的迁移加重肝纤维化［11］；一方面通过释放各种MMPs 分子，降解胶原抑制肝纤维化［7］，考虑双边作用可能与巨噬细胞的M1/M2 分型相关。整体具体作用机制见图1。

图1 肝内的TGF-β1与多种细胞相互作用促进肝纤维化的过程

4 TGF-β1通过活化HSCs促进肝纤维化

活化的HSCs 和肌成纤维细胞是生成ECM 最主要的细胞。在非酒精性脂肪肝（NAFLD）、肝毒素或胆道损伤导致的肝纤维化中，高达85%～95%的肝肌成纤维细胞是通过HSCs 活化形成的，这表明HSCs 活化是肝纤维化的核心事件。其中TGF-β1是促进HSCs激活和增殖的最主要物质，它主要通过触发细胞内的Smad 信号通路和non-Smad 信号通路刺激HSCs活化。

4.1 TGF-β1 通过TGF-β1/Smad 信号通路作用于HSCs 当TGF-β1 刺 激HSCs 启 动Smad 信号 通路时，TGF-β1 首先与细胞膜上的TGF-βⅡ型受体结合，接着招募TGF-βⅠ型受体形成TGF-β-TGF-βⅡ型受体-TGF-βⅠ型受体复合物。随后复合物上的TGF-βⅠ型受体发生构象调节进而活化Smad2、Smad3 蛋白并使二者特异性结合，结合后的Smad2/Smad3 蛋白复合物被磷酸化，并与Smad4 蛋白形成杂配合物被转运到细胞核结合DNA，进而调节多个转录靶基因如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和结缔组织生长因子（CTGF）促进HSCs 活化增殖［10］。此外，TGF-β1 通过激活Smad7 抑制TGF-βⅠ型受体和Smad2/3 的表达进而阻碍TGF- β 信号的过度激活［12］。目前也有大量研究者基于TGF-β1/Smad 信号通路进一步深入探究改善肝纤维化的方法。

4.1.1 TGF-β家族蛋白与Smad信号通路的作用 研究发现，TGF-β1 可激活R-Smad 蛋白中的Smad2 和Smad3蛋白表达，TGF- β家族中的BMP7可激活R-Smad 蛋白中的Smad1、Smad5 和Smad8 蛋白。BMP 和TGF-β1 在信号级联反应中的配体结构和受体结合方式相似，随后都与Smad4蛋白形成复合物，这表明BMP 不仅可能通过与TGF-β 动态竞争参与肝脏发育，还可能参与肝脏纤维的形成［12-13］。在肝纤维化过程中，BMP-7蛋白先升高后降低，这一变化趋势与TGF-β1 呈时间和剂量依赖性的持续增加相关，而外源性BMP-7 可通过上调p-Smad1/5/8 和下调p-Smad3 及p38 的表达抑制HSCs 的活化、迁移和增殖，进一步发挥抗纤维化作用［14］。BMP-2 蛋白能显著抑制TGF-β1及其同源的Ⅰ型、Ⅱ型受体肽表达和HSCs 中的Smad3 磷酸化水平［15］。LEFTY2 作为TGF-β家族蛋白在人肝纤维化组织和四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠模型中明显降低，而在TGF-β1处理的HSCs 中，LEFTY2 的表达也降低。研究发现，过表达的LEFTY2 能通过调节TGF-β1/Smad3 信号通路抑制HSCs的增殖和活化进而减轻肝纤维化［16］。

4.1.2 miRNA 与Smad 信号通路的作用 研究发现，miR-21 可通过抑制Smad7 的表达促进TGF-β1/Smad 信号通路，过表达的miR-21 明显促进了HSCs 增殖，减少了HSCs 凋亡，并增加了胶原表达［17］。在TGF-β1 刺激的HSCs 中存在miR-122，用miR-122 处理可显著降低Smad4 的表达，从而抑制HSCs 的EMT 过程以抑制HSCs 转变为肌成纤维细胞［18］。而Smad4 是miR-34a-5p 的直接靶标，研究发现miR-34a-5p 在人肝硬化和小鼠肝纤维化中减少，当抑制miR-34a-5p 表达时，HSCs 的TGF-β1/Smad3信号通路作用减弱［19］。TGF-β1 可诱导miR-181a 表达，诱导的miR-181a 至少部分通过抑制肝再生因子而诱导肝纤维化，肝再生因子可通过降低TGF-βⅡ型受体的表达进而抑制TGF-β1 的作用［20］。当TGF-β1刺激HSCs 时，Twist1 表达增加，随后Twist1 被转运到细胞核与miR-199a-3p 基因的E-box 元件结合，触发miR-199a 表达。miR-199a-3p 通过抑制CAV2 蛋白，最终抑制CAV2 介导的TGF-βⅠ型受体降解从而激活TGF-β1信号通路［21］。

4.1.3 细胞因子与Smad信号通路的作用 研究发现，IL-26 可通过抑制caspase3 蛋白和Bax 蛋白的表达抑制HSCs 凋亡，并通过上调HSCs 中TGF-β1 和Smad2 的蛋白表达促进HSCs 的增殖和活化［22］。在高分期的肝纤维化中，CXC 趋化因子-6（CXCL-6）表达升高，CXCL-6 可促进枯否细胞释放TGF-β1，释放的TGF-β1 通过SMAD2/BRD4/C⁃MYC/EZH2 信号通路激活HSCs 而促进肝纤维化发展［23］。肝细胞核因子4α（HNF4α）是核激素受体家族的重要转录因子，是正常肝结构、肝细胞形态和功能分化以及肝上皮生成所必需的。在N-二甲基亚硝胺和胆管结扎造成的肝纤维化中，HNF4α 表达下降，在分化的HSCs中注射HNF4α可上调Smad7表达，而Smad7可抑制Smad2磷酸化从而调控EMT过程［24］。

4.1.4 其他与Smad 信号通路的作用 研究表明，组氨酸激酶NME1 和NME2 可通过组氨酸磷酸化介导参与TGF-β1诱导的HSCs活化和四氯化碳诱导的肝纤维化。沉默NME1 或NME2 不仅通过诱导1-磷酸组氨酸和3-磷酸组氨酸表达而减少组氨酸磷酸化，还通过抑制TGF-β1 诱导的Smad2和Smad3 磷酸化这两条途径抑制HSCs 激活［25］。大麻素受体1 在HSCs 中发挥促纤维化作用，当用siRNA 沉默大麻素受体1表达时，TGF-β1被抑制，TGF-βⅡ型受体诱导的Smad 信号传导也被阻断［26］。AGAP2 是一个多任务的GTP 酶活化蛋白，表现GTP 酶活性，参与细胞凋亡、细胞存活、迁移和受体转运相关信号通路的过程。越来越多的证据表明，激活Ras 蛋白是TGF-β1非典型细胞内信号转导的途径，这种Ras 家族的小GTP 酶（包括Rab、Ran 和Rho）都是调控TGF-β1 信号通路的关键组成成分，其作用分别为TGF-β1受体的内吞作用、Smad的转运和与肌动蛋白细胞骨架的交叉作用。此外，现已发现AGAP2 通过参与TGF-βⅡ型受体循环回收到细胞膜的过程参与TGF-β1 的细胞信号转导，最终促进肝纤维化的发生发展［4］。

4.2 TGF-β1 通过TGF-β1/non-Smad 信号通路作用于HSCs 在non-Smad 信号通路中，TGF-βⅠ型受体和TGF-βⅡ型受体形成复合物后，TGF-βⅠ型受体可直接作用或磷酸化激活下游的一系列信号通路，如PI3K/Akt、ERK、p38 MAPK、JNK 和NF-κB 等信号通路，其中部分对Snail1 和Slug 有正向调节作用，最终导致细胞发生EMT 促进肝纤维化发生发展。文献研究发现，Akt 能与未磷酸化的Smad3 作用抑制TGF-βⅠ型受体诱导的Smad3 的激活和核定位，ERK 可直接磷酸化Smad2 和Smad3 以调节其活性，提示non-Smad 信号通路与Smad 信号通路之间可能存在相互作用［10］。

在研究TGF-β1 调节HSCs 中的non-Smad 信号通路机制时发现，miR-21 还可通过抑制SPRY2 激活ERK信号通路［18］。 miR-155 可同时分别与TCF4 mRNA 和AGTR1 mRNA 的3′-UTR 相互作用，其中TCF4是EMT的重要调节剂，AGTR1是ERK1通路的重要调节剂。miR-155 在肝硬化患者、二甲基亚硝胺致大鼠肝纤维化和TGF-β1 激活的HSCs 中降低，增加miR-155 表达可通过该靶基因的作用磷酸化ERK1 抑制HSCs 的EMT，同时miR-155 可抑制细胞凋亡［27］。在HSCs 活化过程中，IL-22 可通过激活p38/MAPK通路激活TGF-β信号通路［28］。

4.3 TGF-β1 通过介质作用于HSCs 组蛋白甲基转移酶EZH2 在TGF-β1 处理的HSCs 中上调，EZH2的过表达可促进ECM 产生，当抑制EZH2 时，TGF-β诱导的HSCs激活也被抑制［29］。TGF-β1不仅能够通过依赖AGAP2 的方式增加PDGF 表达而诱导HSCs增殖，也可以通过AGAP2 的结合伙伴FAK 在诱导HSCs 迁移中发挥作用［4］。CTHRC1 是一种来源于HSCs 的分泌蛋白，在纤维化肝组织中显著上调。CTHRC1 通过激活TGF-β1 信号，促进HSCs 从静止状态向激活状态转化，增强HSCs 的迁移或收缩能力。同时，CTHRC1 选择性激活非经典的Wnt 信号，促进HSCs的收缩和迁移，但不激活HSCs［30］。

4.4 TGF-β1 通过其他细胞作用于HSCs IL-17A可通过招募促炎单核细胞增加TGF-β的表达并增强HSCs中的TGF-β反应［28］。DNA去甲基化酶TET3在应激的肝细胞和HSCs 中增加，TET3 可通过甲基化上调TGF-β1 信号通路中的TGF-β1 表达，而TGF-β1又可刺激TET3的表达，形成TET3 与TGF-β1 在HSCs 和肝细胞中的正反馈回路，最终促进HSCs 激活和ECM 产生而促进肝纤维化发生发展［31］。研究发现，自然杀伤细胞能通过诱导HSCs凋亡缓解肝纤维化，HSCs 分泌的TGF-β1 可诱导自然杀伤细胞凋亡，因此TGF-β1能够阻止自然杀伤细胞清除活化的HSCs［32］。

5 总结与展望

众所周知，TGF-β1是迄今为止发现的最有效的促纤维化细胞因子，肝纤维化也与TGF-β1 关系密切。现有研究发现，在大鼠模型和外周血单个核细胞中，TGF-β1 可通过上调Notch 信号通路抑制肝纤维化逆转的机制促进肝纤维化的发生发展［33］。综上所述，TGF-β1促进肝纤维化发生发展的作用机制复杂，大量研究学者仍在不断探索中，但通过抑制TGF-β1 及其相关的通路蛋白等方式抑制肝纤维化的发生发展是关键环节之一。探索TGF-β1 如何促进肝纤维化有助于丰富改善肝纤维化的方式，最终以期找到更好的治疗肝纤维化的方法应用于临床。